Генетически маркировки отдельных клеток с флуоресцентными белками и после этих клеток с течением времени, Конфетти мышь позволила исследователям выявить новые идеи во многих биологических процессов. Наш протокол сводит к минимуму время задержки между сбором тканей и визуализацией, может применяться к любой минерализованной или неминерализации тканей и сохраняет флуоресценцию в течение нескольких лет. Этот метод очень полезен для всех областей регенеративной медицины и биологии развития, потому что он может быть применен к различным клеточным популяциям для изучения их судьбы и их кинетики до тех пор, пока доступна подходящая линия Cre.
Наши пошаговые инструкции продемонстрируют самый сложный шаг, чтобы различать разницу флуоресцентных сигналов, испускаемых различными флуоресцентными белками. Начните с подготовки ткани мыши для визуализации. Для мягких тканей и минерализованных tibiae и бедренной кости от мышей до 45 дней, исправить ткани в предварительно заколенной 3,7%формальдегида PBS и инкубировать его при 4 градусах по Цельсию в течение шести часов, а прокатки мягко на ротатор.
Для минерализованных тканей, таких как голени и бедренной кости от мышей в возрасте старше 45 дней, подготовить один литр 10%EDTA раствор с рН скорректированы до 8,05 с гидроксидом натрия и разбавить формальдегид до 3,7% с помощью этого решения. Исправить ткани, сохраняя его в 3,7%формальдегид PBS ночь на 4 градуса по Цельсию. На следующий день поместите его в предварительно обожожте раствор формальдегида EDTA и инкубировать его при 4 градусах по Цельсию при стыя в течение 48 часов, убедившись, что заменить раствор три раза во время инкубации.
Затем поместите ткань в предварительно заколеной 30% сахарозы, убедившись, чтобы заполнить контейнер до краев, и аккуратно поверните его на ночь при четырех градусах по Цельсию. Утром используйте типсы, чтобы удалить ткань из раствора сахарозы и промыть его в пять миллилитров оптимального соединения температуры резки, или OCT, в течение нескольких секунд. Заполните предварительно помечены криомольда с OCT и положение ткани в нижней части, работая быстро, чтобы избежать образца сидит при комнатной температуре слишком долго.
Встраивание образца путем размещения формы на сухом льду и ожидания OCT затвердеть. Если образцы используются не сразу, они могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Удалите блок из формы.
Применить OCT между верхней части блока и патрон и охладить его в криостат, по крайней мере пять минут или до тех пор, пока OCT полностью затвердевает. Предварительно застелите держатель образца и держатель лезвия до минус 20 градусов по Цельсию, затем поместите образец в держатель патрона и лезвие в держатель лезвия, и дайте им уравночные в течение нескольких минут. Для послеродового анализа пластин роста подготовьтесь к разделам, которые от 30 до 160 микрометров.
Используйте криостат, чтобы обрезать блок и сократить секции тканей до подходящей толщины и собирать их на слайдах. Затем воздух сушит горки при комнатной температуре до тех пор, пока они полностью не высохнут, и храните их при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 36 месяцев. Когда он будет готов к использованию слайда, удалите его из морозильной камеры и доввелите до комнатной температуры в держателе слайда.
Чтобы удалить OCT, аккуратно нанесите PBS на слайд с пипеткой Pasteur. В течение 160 микрометров толщиной разделы, инкубировать слайд в течение 15 минут, удалить жидкость и применять свежие PBS в течение еще пяти минут. Намонтировать горки в растворе 75%thiodiethanol при комнатной температуре с 60 миллиметров длиной крышки скользит.
Во-первых, выберите канал RFP, нажав на него во вкладке каналов, что приводит к тому, что детали канала отображаются во вкладке «Путь света». Затем нажмите галочку поле рядом с T-PMT. Поместите слайд в держатель слайда и распоимить ткани, представляющие интерес непосредственно между световой траекторией и объективом.
Чтобы локализовать ткани, отсоедините коробки YFP и CFP под заголовком заголовок вкладки каналов. Выберите канал T-PMT в заголовке треков, а затем нажмите в прямом эфире во вкладке приобретения и увеличить прибыль для канала T-PMT для того, чтобы визуализировать выбор тканей на экране. Отрегулируйте положение слайда, чтобы найти область интереса и фокус с помощью соответствующей ручки микроскопа.
Затем нажмите стоп в вкладке приобретения, чтобы отключить лазерное воздействие. Определите параметры изображения в соответствии с инструкциями рукописи и при необходимости отрегулируйте размер пинхол. Проверьте настройку, чтобы убедиться, что записанные сигналы не перекрываются, а затем выберите все три канала во вкладке каналов и нажмите кнопку привязки.
Прокрутите между каналами отображения в полученном изображении, нажав на синие выделенные коробки над каждым каналом во вкладке размеров и вручную проверьте перекрытие между каналами на экране. Если сигналы перекрываются, корректируете параметры до тех пор, пока они не будут отличаться друг от друга. Этот протокол был использован для обозначения хондроцитов в эпифизального хряща и визуализировать их клонального расширения с возрастом.
Центральная секция была определена путем визуализации крестообразной связки и клонов в проксимальной плите роста трибия были изображены. Индивидуальные клетки, которые были Col2 положительные и стал помечены флуоресцентными белками Confetti при введения тамоксифена, подверглись клонального расширения и впоследствии остались в пластине роста. Флуоресцентный сигнал можно визуализировать после длительного хранения.
Некоторые секции хранились более трех лет до подготовки и визуализации. Трехмерная реконструкция проводилась автоматически с помощью программного обеспечения для анализа изображений и экспортировалась в качестве видео. Один раздел, сломанный во время криозирования, содержит область с таким высоким уровнем рекомбинации, что предотвратит клональный анализ, демонстрируя одну из общих проблем, с которыми сталкивается этот протокол.
В зависимости от вашего исследовательского вопроса, использование линии Cre, которая конкретно маркирует ваши клетки, представляющие интерес, может быть очень важным. Поэтому мы рекомендуем проверить флуоресценцию в этих клетках вскоре после рекомбинации. Использование неосуществимых линий Cre имеет важное значение, потому что продолжающаяся рекомбинация ДНК в неиспасимых линиях Cre может изменить флуоресцентный профиль растворимых клеток, тем самым исключая клональный анализ.
Этот протокол можно сочетать с функциональными возмущениями, такими как генетически манипулируемые штаммы, фармакологические методы лечения, хирургические вмешательства, а также иммунофлуоресцентное окрашивание подготовленных секций.
