من خلال وضع العلامات الجينية على الخلايا الفردية ببروتينات الفلورسنت واتباع تلك الخلايا بمرور الوقت ، سمح ماوس Confetti للباحثين بالكشف عن رؤى جديدة في العديد من العمليات البيولوجية. بروتوكول لدينا يقلل من الوقت الفاصل بين جمع الأنسجة والتصوير، ويمكن تطبيقها على أي الأنسجة المعدنية أو غير المهدنة ويحافظ على الفلورسين لعدة سنوات. هذه الطريقة مفيدة جدا لجميع مجالات الطب التجديدي والبيولوجيا التنموية لأنه يمكن تطبيقها على مختلف السكان الخلوية لدراسة مصيرهم وحركيتهم طالما أن خط Cre مناسب متاح.
سوف تظهر تعليماتنا خطوة بخطوة الخطوة الأكثر تحدياً للتمييز بين الاختلاف بين الإشارات الفلورية المنبعثة من البروتينات الفلورية المختلفة. ابدأ بإعداد أنسجة الماوس للتصوير. بالنسبة للأنسجة الرخوة والثنية المعدنية والفيمورا من الفئران التي يصل عمرها إلى 45 يومًا ، قم بإصلاح الأنسجة في 3.7٪ الفورمالديهايد PBS واحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة ست ساعات بينما تتدحرج بلطف على دوار.
بالنسبة للأنسجة المعدنية مثل الساق والفيتامرا من الفئران فوق عمر 45 يومًا ، أعد لترًا واحدًا من محلول 10٪EDTA مع تعديل pH إلى 8.05 مع هيدروكسيد الصوديوم وتمييع الفورمالديهايد إلى 3.7٪ باستخدام هذا الحل. إصلاح الأنسجة عن طريق الاحتفاظ بها في 3.7٪ الفورمالديهايد برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، ضعه في محلول الفورمالديهايد EDTA المُبَرَّك ويحتضنه عند 4 درجات مئوية أثناء الدوران لمدة 48 ساعة، مع التأكد من استبدال المحلول ثلاث مرات أثناء الحضانة.
ثم ضع الأنسجة في سكروز 30٪، مع التأكد من ملء الحاوية إلى الحافة، وتدوير بلطف بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في الصباح، استخدم ملقط لإزالة الأنسجة من محلول السكروز وشطفه بخمس ملليلترات من مركب درجة حرارة القطع الأمثل، أو أكتوبر، لبضع ثوان. ملء cryomold المسمى مسبقا مع أكتوبر ووضع الأنسجة في الجزء السفلي، والعمل بسرعة لتجنب الجلوس العينة في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة جدا.
تضمين العينة عن طريق وضع القالب على الجليد الجاف وانتظار أكتوبر لترسيخ. إذا لم يتم استخدام العينات على الفور، يمكن تخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. إزالة كتلة من القالب.
تطبيق أكتوبر بين الجزء العلوي من الكتلة وتشاك وتبريده في التبريد لمدة خمس دقائق على الأقل أو حتى OCT يقوي تماما. Precool حامل العينة وحامل شفرة إلى ناقص 20 درجة مئوية، ثم ضع العينة في حامل تشاك ونصلة في حامل شفرة، والسماح لهم لتكواسير لعدة دقائق. بالنسبة لتحليل لوحة النمو بعد الولادة، أعد أقسامًا من 30 إلى 160 ميكرومتر.
استخدام التبريد لتقليم كتلة وقطع أقسام الأنسجة إلى سمك مناسب وجمعها على الشرائح. ثم الهواء الجافة الشرائح في درجة حرارة الغرفة حتى أنها جافة تماما وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 36 شهرا. عندما تكون جاهزة لاستخدام الشريحة، إزالتها من الثلاجة وتقديمها إلى درجة حرارة الغرفة في حامل شريحة.
لإزالة OCT، تطبيق برنامج تلفزيوني بلطف على الشريحة مع ماصة باستور. لمدة 160 ميكرومتر سميكة المقاطع، احتضان الشريحة لمدة 15 دقيقة، وإزالة السائل وتطبيق برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمس دقائق أخرى. جبل الشرائح في حل من 75٪ thiodiethanol في درجة حرارة الغرفة مع 60 ملليمتر زلات غطاء طويل.
أولاً، حدد قناة RFP بالنقر عليها في علامة التبويب القنوات، مما يؤدي إلى عرض تفاصيل القناة في علامة التبويب مسار الضوء. ثم انقر فوق مربع الاختيار بجانب T-PMT. ضع الشريحة في حامل الشريحة ووضع الأنسجة ذات الاهتمام مباشرة بين مسار الضوء والعدسة الهدف.
لتوطين الأنسجة، قم بإلغاء تحديد صناديق YFP و CFP تحت عنوان المسارات لعلامة التبويب القنوات. حدد قناة T-PMT في عنوان المسارات، ثم انقر مباشرة في علامة التبويب الاستحواذ وزيادة مكاسب لقناة T-PMT من أجل تصور اختيار الأنسجة على الشاشة. ضبط موقف الشريحة لتحديد المنطقة ذات الاهتمام والتركيز باستخدام مقبض المجهر المناسب.
ثم انقر فوق إيقاف في علامة التبويب اكتساب لإيقاف التعرض بالليزر. حدد معلمات التصوير وفقًا لتعليمات المخطوطات، ثم قم بتعديل حجم الثقب إذا لزم الأمر. تحقق من الإعداد للتأكد من أن الإشارات المسجلة لا تتداخل، ثم حدد جميع القنوات الثلاث في علامة التبويب القنوات واضغط على زر الانطباق.
قم بالتمرير بين قنوات العرض في الصورة الناتجة عن طريق النقر على المربعات الزرقاء المظللة أعلى كل قناة في علامة تبويب الأبعاد والتحقق يدويًا من التداخل بين القنوات على الشاشة. إذا تداخلت الإشارات، قم بإعادة ضبط المعلمات حتى يمكن تمييزها عن بعضها البعض. تم استخدام هذا البروتوكول لتسمية chondrocytes في الغضروف epiphyseal وتصور توسعها التخفي مع التقدم في السن.
تم تحديد القسم المركزي من خلال تصور الرباط الصليبي وتم تصوير المستنسخات في لوحة النمو التيبية القريبة. الخلايا الفردية التي كانت كول2 إيجابية وأصبحت وصفت مع البروتينات الفلورية Confetti على إدارة تاموكسيفين، خضع التوسع التخفي وبقي في وقت لاحق في لوحة النمو. ويمكن تصور إشارة الفلورسنت بعد التخزين على المدى الطويل.
تم تخزين بعض الأقسام لأكثر من ثلاث سنوات قبل التحضير والتصوير. وقد أجريت إعادة البناء ثلاثية الأبعاد تلقائيا مع برنامج تحليل الصور وتصديرها كفيديو. قسم واحد كسر أثناء خطوة التبريد يحتوي على منطقة مع هذا المستوى العالي من إعادة التركيب أنه من شأنه أن يمنع تحليل التخفي، مما يدل على واحدة من المشاكل الشائعة التي واجهتها مع هذا البروتوكول.
اعتمادا على سؤال البحث الخاص بك، وذلك باستخدام خط Cre التي تسميات على وجه التحديد الخلايا الخاصة بك من الفائدة يمكن أن تكون مهمة جدا. لذلك، نوصي بفحص الفلورس في تلك الخلايا بعد وقت قصير من إعادة التركيب. استخدام خطوط Cre غير قابل للتكرير أمر ضروري لأن إعادة التشكيل المستمر للحمض النووي في خطوط Cre غير قابلة للاختراق يمكن أن يغير الملف الفلوري للخلايا المتحللة مما يحول دون التحليل الزني.
ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع اضطرابات وظيفية مثل سلالات التلاعب وراثيا، والعلاجات الدوائية، والتدخلات الجراحية، فضلا عن تلطيخ الفلوروس المناعي من أقسام المعدة.
