세포 없는 단백질 합성은 단백질의 체외 생산을 위한 시스템 및 합성 생물학에서 새로운 기술입니다. 세포없는 단백질 합성 시스템은 세포벽이 없으므로 대사 산물에 직접 접근할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 우리가 세포 없는 신진 대사를 특징지을 수 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시키는 40개의 대사 산물의 절대 측정을 정량화합니다.
프로토콜은 더 나은 분리 및 더 높은 질량 분광법 해상도를 허용하는 애니라인으로 화합물을 전이에 의존합니다. 또한, 대사 산물의 절대적인 정량화를 위해, 우리는 애니라인을 라벨을 붙이는 등소와 내부 표준을 사용합니다. 태그된 대사산물은 철 분억제효과를 제거하는 코엘루테를 제거합니다.
화합물의 정확한 정량화를 허용합니다. 후드에서 작업, 결합 550 애니라인의 마이크로 리터, LC-MS 등급 물의 337.5 마이크로 리터와 결합. 그리고 원심분리기 튜브에 12개의 어금다 염산의 112.5 마이크로리터.
소용돌이 잘, 그리고 pH 4.5 및 섭씨 4도에 6 개의 어니라인 용액을 저장합니다. 6개의 어금니 카본-13 애니라인 용액을 pH 4.5에서 250밀리그램의 탄소-13 애니라인을 132마이크로리터의 물과 결합하고, 12개의 어금니 염산의 44마이크로리터를 결합합니다. 소용돌이 잘, 4 섭씨에 저장합니다.
밀리리터 EDC 용액당 200밀리그램을 준비하려면 모든 샘플에 태그를 지정할 수 있도록 10마이크로리터의 물에 EDC 2밀리그램을 녹입니다. 그리고 소용돌이 잘. 시료를 준비하려면, 담금질과 세포없는 단백질 합성 반응에서 단백질을 침전, 세포없는 합성 반응에 얼음 차가운 100% 에탄올의 동등한 양을 추가하여.
원심 분리는 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다. 샘플의 상체를 새로운 원심분리기 튜브로 옮는다. 카본-12 애니라인 용액으로 시료에 라벨을 부착하려면 샘플의 6마이크로리터를 새로운 원심분리기 튜브로 옮기고 물로 50마이크로리터에 부피를 전달합니다.
밀리리터 EDC 솔루션당 5마이크로리터를 200밀리그램 으로 추가하고, 탄소-12 애니라인 용액을 잘 혼합하고, 5마이크로리터를 튜브로 옮킨다. 실온에서 2 시간 동안 부드러운 흔들림으로 반응을 소용돌이. 2시간 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 연기 후드로 옮킨다.
각 반응에 트리에틸라민 1.5 마이크로리터를 추가하여 애니라인 태깅 반응을 중지하고 화합물을 안정화시하십시오. 원심분리기는 13, 500배 3분간. 그리고 상체를 저장합니다.
탄소-13 애니라인 솔루션으로 내부 표준을 레이블을 지정하려면 내부 스톡 솔루션을 50마이크로리터의 최종 부피로 80 마이크로몰러로 희석하십시오. 밀리리터 EDC 솔루션당 200밀리그램의 마이크로리터 5개, 잘 혼합된 탄소-13 애니라인 용액5개에 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 부드러운 흔들림으로 반응을 소용돌이.
2 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고, 연기 후드의 반응에 트리에틸라민의 1.5 마이크로 리터를 추가합니다. 원심분리기는 13, 500배 g에서 3분간, 상수체를 저장합니다. 태그가 지정된 내부 표준과 태그가 지정된 샘플을 신성하게 하기 위해 각 마이크로리터를 자동 샘플러 바이알에 혼합합니다.
그리고 LC-MS 절차에 의해 분석. 그런 다음, 태그가 지정되지 않은 대사 산물에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해 먼저, 50 마이크로리터의 부피와 함께 태그가 지정되지 않은 대사 산물의 스톡 용액을 다른 농도로 희석한다. 밀리리터 EDC 솔루션당 200밀리그램의 마이크로리터 5개, 각 농도에 탄소-12 애니라인 용액 5개를 추가합니다.
실온에서 2 시간 동안 부드러운 흔들림으로 반응을 소용돌이. 그리고 트리에틸라민 치료를 진행한다. 그리고 과거와 같이 LC-MS에 의해 분석하기 전에 원심화.
제조업체의 지침에 따라 LC-MS를 초기화한 후 샘플의 마이크로리터 5기를 컬럼에 주입합니다. 그리고 탄소-12 애니라인 태그 시료에 대한 z 이온 강도에 대한 적절한 m을 획득한다. 그런 다음 동일한 샘플의 5 개의 마이크로 리터를 다시 주입하십시오.
그리고 탄소-13 애니라인 태그 표준에 대한 m over z 이온 강도를 획득한다. 본 프로토콜에서, 대장균 계 세포 없는 단백질 합성에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 대사산물이 정량화되었다. 중앙 탄소 및 에너지 대사에 관여하는 40개의 대사산물은 내부 표준을 사용하여 검출및 정량화되었다.
애니라인으로 태그되지 않은 대사 산물 5개에 대한 표준 곡선도 개발되었다. 이 통로에 관련되었던 각종 대사산물은 인광성 설탕, 인계 카복실산, 카복실산, 뉴클레오티드 및 공동 인자의 부류였습니다. 또한, 이 방법은 단일 LC-MS 런에서 포도당-6인산염 및 과당-6인산염과 같은 구조적 이소성 쌍의 분리를 가능하게 하였다.
가장 중요한 단계는 단백질분해된 샘플을 애니라인으로 라벨링하는 것입니다. 애니라인 솔루션이 분리되기 때문에 우수한 안전 관행을 유지하면서 신속하고 효과적으로 작업하는 것이 중요합니다. 이 방법은 40 대사 산물의 정량화와 세포없는 신진 대사를 특성화하는 데 도움이됩니다.
그러나, 추가 화합물은 정량화될 수 있는 아미노산과 같은 세포없는 혼합물에 있다. 이 세포 없는 신진 대사에 더 포괄적인 모양을 제공에 도움이 될 것 이다. 이 방법은 세포 없는 시스템이 복잡한 신진 대사를 가지고 있으며, 여전히 더 나은 에너지 효율과 탄소 수율을 위해 잠재적으로 악용될 수 있는 작동을 가지고 있음을 밝혔습니다.
프로토콜은 EDC를 촉매로 사용하여 애니라인으로 화합물을 태그하는 데 의존합니다. 이 시약은 모두 위험하며 주의해서 사용해야 합니다.
