В этом протоколе описывается методика таргетинга препаратов, представляющих интерес для личинородных макрофагов зебры, для манипулирования и оценки функции макрофага. Этот метод имеет преимущества по сравнению с традиционными стратегиями доставки наркотиков, такими как погружение, гарантируя, что препараты специально ориентированы на макрофаги через липосомную инкапсуляцию. При применении к зебрафиш модели болезни с воспалительным компонентом, этот метод имеет потенциал, чтобы решить, как макрофаги способствуют патологических процессов.
Здесь мы демонстрируем полезность этого метода, ориентируясь на митохондриальной реакции кислорода видов ингибирования наркотиков макрофагов для подавления активации. Микроинъекция нагруженных наркотиками липосом в личинки может быть сложной задачей, так как следует позаботиться о том, чтобы не вызвать чрезмерного эпителиального повреждения, потенциально влияющих на иммунологические исследования. Визуальная демонстрация этого протокола имеет важное значение, поскольку она включает в себя фармакологические и целые методы живых клеток животных, которые не могут регулярно выполняться в одной лаборатории.
Чтобы подготовить 10 миллиграммов липосом в 25-миллилитровой колбе круглого дна, добавьте в колбу 31 наномоляр морского синего и 300 наномоляр митохондриальных кислородных видов. Sonicate кратко полностью растворить, и удалить растворитель медленно на роторный испаритель установлен на 45-градусной водяной бане по Цельсию на 75 вращений в минуту под вакуумным давлением. Когда сухая липидная тонкая пленка образуется в стеклянных стенках колбы, далее высушите пленку в течение 45 минут под азотом, чтобы облегчить полное удаление органического растворителя.
Затем увлажнять пленку одним миллилитром PBS и запечатать колбу парафиновой пленкой, прежде чем агитировать колбу вручную над 60-градусной водяной баней по Цельсию в течение 20 минут. После семи циклов замораживания и оттаивания используйте мини-экструдер и одномимберные травленые поликарбонатные мембраны для экструдирования липосом в течение двух-шести циклов. Когда большие unilamellar пузырьки были получены, конденсировать свежие липосомы в гранулы ультрацентрифугации.
Инкубировать гранулы с одним миллилитр 1%poloxamer 188 раствор в течение 30 минут при 45 градусов по Цельсию и 750 оборотов в минуту в ThermoMixer с двухми миллилитров микроцентрифуг трубки крепления. Во время после вставки полоксамера 188 в липосомы, правильная концентрация полоксамера, время инкубации и температура имеют важное значение для достижения оптимальных физикохимических характеристик полученных липосом. В конце инкубации, ультрацентрифуг смеси снова в тех же условиях центрифуги, и удалить супернатант, содержащий любой несъеверхающий полимер или препарат.
Затем храните липосомные гранулы при четырех градусах Цельсия, защищенные от света. Чтобы определить размер и потенциал зеты липосом, разбавить липосомную формулировку ультрапурной водой в соотношении один к 100. Используйте динамический свет рассеяния анализатор для измерения размера частиц, индекс полидисперсности, и зета потенциал в тройной при 25 градусов по Цельсию.
Чтобы рассчитать эффективность захвата и нагрузку препарата липосом, растворите липосомы в Triton X-100. Ввените 20 микролитров растворенного липосомного образца в систему жидкой хроматографии высокого давления с четвертичных насосов, детектор диодного массива, установленный на 230 нанометров, и трехмиллиметровую, 250-4,6-миллиметровую колонку. Для подготовки трансгенных личинок зебры к инъекциям используйте миппы тонкой наконечника для ручного дехорионата 30 часов после оплодотворения эмбрионов, а также позволяют эмбрионам развиваться при 28,5 градусах Цельсия до двух дней после оплодотворения.
Когда эмбрионы достигли соответствующей стадии, разбавить свежеприготовленную липосомную формулировку в соотношении один к одному в стерильном PBS, и смешать раствор в течение двух-трех секунд вихрем. Налейте достаточно 3%метил-целлюлозы в E3 среды в крышку небольшой, 35-миллиметровой культуры блюдо крышкой, чтобы сформировать тонкую пленку, покрывающую всю поверхность. Используйте пластиковую трубу для переноса, чтобы собрать пул из примерно 20-25 анестезированные личинки.
Позвольте эмбрионам сконцентрироваться на кончике пипетки под действием силы тяжести и тщательно перенести личинки в середину 35-миллиметровой крышки тарелки культуры с минимальным раствором. Используйте микрокапильярный погрузчик, чтобы организовать личинки с передними к верхней части пластины инъекции с спинной поверхности, обращенной к микроинъекции иглы для инъекции в желудочек заднего мозгины или с их передней части пластины инъекций с брюшной поверхности, обращенной к микроинъекции иглы для инъекции в пазуху веноз. Используйте микрокапильярный погрузчик для заполнения иглы инъекций примерно пятью микролитров липосомной инъекционной смеси.
Намонтировать иглу в микроманипулятор, подключенный к магнитной подставе и инжектору давления, и распоставить установку под стерео микроскопом. Используйте чистые, тонкие типсы, чтобы сократить кончик микроинъекции иглы для создания открытия около пяти микрометров в диаметре. Установите инжектор на пульс продолжительность около 50 миллисекунд и давление инъекции около 40 фунтов на квадратный дюйм.
Введать болюс в каплю минерального масла, расположенного над сеткой линий гемоцитометра для калибровки объема, который будет введен. Затем отрегулируйте продолжительность пульса и/или давление впрыска до тех пор, пока диаметр болуса не покрывет 2 1/2 самых маленьких линий сетки. Аккуратно ввилите один нанолитер липосомной инъекционной смеси в желудочек заднего мозги каждой личинки.
Сразу же после инъекций, добавить E3 среды для инъекционной пластины, и использовать пластиковые трубы передачи мягко агитировать личинок из метил-целлюлозы. Чтобы изображение спинной поверхности заднего сала на конфокальный микроскоп оснащен объективом погружения в воду, сначала заполнить 35-миллиметровую культуру блюдо на глубину до пяти миллиметров с монтажной среды, и пусть средний полимеризации. Раскопки небольшой траншеи в агарозе достаточной площади для размещения желточного мешка экспериментального эмбриона, и использовать пластиковые трубы передачи заполнены расплавленной монтажной среды для сбора анестезированные личинки.
Немедленно снизите личинку в блюдо культуры, и используйте микрокапильярный погрузчик, чтобы сориентировать желток сакральной стороны вниз в раскопки отверстия. Поддерживайте эмбрион в этом положении до тех пор, пока агароза не полимеризируется. Наложить эмбрион со средой Е3, дополненной 200 микрограммами на миллилитр tricaine.
Чтобы жить изображение желудочка заднего мира, выберите цель 20x, и установить конфокальный микроскоп до 512 на 512 пикселей и 2,5x зум. Когда параметры микроскопа были установлены, приобрести 40 на три микрометра - стеки, простирающиеся от спинной самой поверхности заднего мозга с помощью двухканальной визуализации для изображения синих флуоресцентных липосом и зеленых флуоресцентных макрофагов. Когда все изображения были получены, загрузите файлы в соответствующую программу анализа 3D-изображений.
Под вкладкой Измерения перетащите протокол «Найти объекты» в задачи перетаскивания здесь, чтобы сделать измерения пространством. Выберите канал DAPI, чтобы выделить липосомы, и перетащите инструмент Inspect через секции для обнаружения липосомных макрофагов. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции липосом в отдельных клетках перетащите протокол Clip To Regions Of Interest в пространство Drag Tasks Here To Make Measurements и используйте инструмент Rectangle, чтобы нарисовать коробку вокруг ячейки, заинтересованной в измерениях X, Y и q.
Затем выберите Make Measurement Item из меню высадки измерений для создания файла измерения в окне библиотеки. В этой таблице суммируются размеры, потенциал зеты, загрузка лекарств и эффективность захвата производимых липосом. Как было отмечено, размер частиц липосомы похож с и без нагрузки наркотиков, хотя поверхностный заряд наркотиков загруженных липосом немного более нейтральным, чем контроль липосомы с морской синий только.
Микроинъекция морских голубых липосом в желудочек заднего бора, как попродемонстрировано, приводит к быстрому поглощению резидентами макрофагов, которые могут быть легко количественно конфокальные микроскопии на три часа после инъекции. Нейтрофилов, однако, редко наблюдается содержать внутриклеточные липосомы. В отдельных липосомных макрофагах липосомы накапливаются в фаголизомальных отсеках, что необходимо для деградации липосомы и последующего высвобождения содержания препарата в цитоплазму.
Доставка в синус venosus может доставить липосомы в каудальные гематопоэтические ткани резидентов макрофагов через циркуляцию. Микроинъекция липосом, нагруженных митохондриальной реакцией кислорода видов ингибирования наркотиков в желудочек заднего бора может значительно подавить мононатрия урат кристалла инициативе митохондриальной реакции кислорода производства в липосомы груженых задних ординаторов макрофагов. Дальнейшая проверка подавляющих эффектов препаратов, представляющих интерес для состояний активации макрофагов, может быть выполнена путем изучения провоспламеняющей экспрессии генов цитокинов путем гибридизации всего крепления на месте и временного набора нейтрофилов.
Используя этот метод, мы смогли нацелить препараты на макрофаги, чтобы подтвердить, что иммунометаболический механизм приводит к их активации в личинородной модели зебры при остром подагрическом воспалении. Будущие адаптации этого протокола могут включать в себя выполнение поверхностной модификации липосомы для повышения макрофаг ориентации или содействовать ориентации на другие иммунные клетки, такие как нейтрофилов.
