פרוטוקול זה מתאר טכניקה לפילוח תרופות מעניינות כדי לזחל מקרופאגים זברה כדי לתפעל ולהעריך פונקציית מקרופאג. טכניקה זו יש יתרונות על פני אסטרטגיות משלוח תרופות מסורתיות כגון טבילה על ידי הבטחת כי התרופות ממוקדות במיוחד מקרופאגים באמצעות אנקפסולציה liposome. כאשר מוחל על מודלים זברה של מחלה עם מרכיב דלקתי, טכניקה זו יש פוטנציאל לפתור כיצד מקרופאגים לתרום תהליכים פתולוגיים.
כאן, אנו מדגימים את התועלת של טכניקה זו על ידי מיקוד תרופה מעכבת מיני חמצן מיטוכונדריאלי-תגובתי מקרופאגים כדי לדכא את ההפעלה. microinjection של ליפוזומים טעון סמים לתוך הזחלים יכול להיות מאתגר, כמו טיפול יש לנקוט כדי לא לגרום נזק אפיתל מוגזם, פוטנציאל להשפיע על מחקרים אימונולוגיים. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה חשובה משום שהיא כרוכה במתודולוגיות תאים חיים פרמקולוגיים ובעלי חיים שלמים שלא ניתן לבצע באופן שגרתי במעבדה אחת.
כדי להכין 10 מיליגרם של ליפוזומים בבקבוק 25 מיליליטר עגול תחתון, להוסיף 31 nanomolars של כחול ימי 300 nanomolars של מיטוכונדריאלי תגובתי מינים מעכבי זן לבקבוק. Sonicate לזמן קצר כדי להתמוסס באופן מלא, ולהסיר את הממס לאט על אידוי סיבובי להגדיר מעל אמבט מים 45 מעלות צלזיוס ב 75 סיבובים לדקה תחת לחץ ואקום. כאשר סרט דק שומנים יבש נוצר בתוך קירות הזכוכית של הבקבוק, עוד יותר לייבש את הסרט במשך 45 דקות תחת חנקן כדי להקל על הסרה מלאה של הממס האורגני.
לאחר מכן, לחות את הסרט עם מיליליטר אחד של PBS, ולאטום את הבקבוק עם סרט פרפין לפני תסיסה את הבקבוק ביד על 60 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 20 דקות. לאחר שבעה מחזורים של הקפאה והפשרה, השתמשו במיני-אקסטרודר ובמיקרומטר אחד של קרום פוליקרבונט חרוט כדי להחדיר את השומומים במשך שניים עד שישה מחזורים. כאשר וריקלים unilamellar גדולים הושגו, לדחוס את ליפוזומים טריים לתוך גלולה על ידי אולטרה צנטריפוגה.
הדגירה את גלולה עם מיליליטר אחד של 1%poloxamer 188 פתרון במשך 30 דקות ב 45 מעלות צלזיוס ו 750 סיבובים לדקה ב ThermoMixer עם חיבור צינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר. במהלך החדרת פוסט poloxamer 188 לתוך ליפוזומים, ריכוז poloxamer הנכון, זמן הדגירה, והטמפרטורה חשובים להשגת המאפיינים הפיזיוכימיים האופטימליים של ליפוזומים וכתוצאה מכך. בסוף הדגירה, ultracentrifuge את התערובת שוב באותם תנאי צנטריפוגה, ולהסיר את supernatant המכיל כל פולימר או תרופה לא מאוגדת.
לאחר מכן לאחסן את כדורי ליפוזום בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור. כדי לקבוע את הגודל ואת הפוטנציאל זטה של ליפוזומים, לדלל את ניסוח ליפוזום עם מים אולטרה-100 ביחס של אחד ל -100. השתמש במנתח פיזור אור דינמי כדי למדוד את גודל החלקיק, מדד הפולידיספרסיות ופוטנציאל הזטה ב-25 מעלות צלזיוס.
כדי לחשב את יעילות המלכודת ואת טעינת הסמים של ליפוזומים, להמיס את ליפוזומים טריטון X-100. הזרק 20 מיקרוליטרים של דגימת ליפוזום מומסת למערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם משאבה quaternary, גלאי מערך דיודה להגדיר ב 230 ננומטר, וטור שלושה מיקרומטר, 250 פעמים-4.6 מילימטר. כדי להכין זחלי זברה מהונדסים להזרקה, השתמש במטסים עדינים כדי לפענח ידנית 30 שעות לאחר ההפריה, ולאפשר לעוברים להתפתח ב-28.5 מעלות צלזיוס עד יומיים לאחר ההפריה.
כאשר העוברים הגיעו לשלב המתאים, מדללים ניסוח ליפוזום טרי ביחס של אחד לאחד ב- PBS סטרילי, ומערבבים את הפתרון במשך שתיים עד שלוש שניות על ידי מערבולת. יוצקים מספיק תאית מתיל 3% במדיום E3 לתוך המכסה של מכסה צלחת קטן, 35 מילימטר תרבות כדי ליצור סרט דק מכסה את פני השטח כולו. השתמש פיפטה העברת פלסטיק כדי לאסוף בריכה של כ 20 עד 25 זחלים הרדמה.
אפשר לעוברים להתרכז בקצה הפיפסה בכוח הכבידה, ולהעביר בזהירות את הזחלים לאמצע מכסה צלחת התרבות 35 מ"מ עם פתרון מינימלי. השתמש מטעין microcapillary כדי לסדר את הזחלים עם הקדמיים שלהם לכיוון החלק העליון של צלחת ההזרקה עם משטח הגב פונה לכיוון מחט microinjection להזרקה לתוך החדר hindbrain או עם הקדמיים שלהם לכיוון החלק השמאלי של צלחת ההזרקה עם משטחי הגחון פונה לכיוון מחט microinjection להזרקה לתוך ונוסוס סינוס. השתמש מטעין microcapillary כדי למלא בחזרה מחט הזרקה עם כחמישה microliters של תערובת הזרקת ליפוזום.
הר את המחט לתוך מיקרומניפולטור המחובר לעמדה מגנטית ומזרק לחץ, והצב את ההתקנה תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש נקי, ממטרים קצה דק לחתוך את קצה המחט microinjection כדי ליצור פתח של כחמישה מיקרומטר קוטר. הגדר את המזרק למשך פולס של כ 50 אלפיות שנייה ולחץ הזרקה של כ 40 פאונד לאינץ 'מרובע.
להזריק בולוס לתוך טיפה של שמן מינרלי ממוקם מעל קווי הרשת של hemocytometer כדי לכייל את הנפח להיות מוזרק. לאחר מכן להתאים את משך הדופק ו / או את לחץ ההזרקה עד קוטר הבולוס מכסה 2 1/2 של קווי הרשת הקטנים ביותר. בזהירות להזריק nanoliter אחד של תערובת הזרקת ליפוזום לתוך החדר האחורי של כל זחלים.
מיד לאחר הזריקות, מוסיפים מדיום E3 לצלחת ההזרקה, ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק בעדינות להתסיס את הזחלים מתוך תאית מתיל. כדי לדמיין את המשטח הגבי של ההידברות על מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשת טבילה במים, מלא תחילה צלחת תרבות של 35 מ"מ לעומק של חמישה מילימטרים עם מדיום הרכבה, ותן למדיום לפולימר. חפר תעלה קטנה באזרוז של שטח מספיק כדי להכיל את שקי החלמון של העובר הניסיוני, ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק מלא מדיום הרכבה מותכת כדי לאסוף זחל הרדמה.
מיד להפקיד את הזחל לתוך צלחת התרבות, ולהשתמש מטעין microcapillary כדי לכוון את צד הגחון חלמון למטה לתוך החורים שנחפרו. שמור על העובר בתמורת זו עד שהתעוררות פולמריזציה. כיסוי העובר עם E3 בינוני בתוספת 200 מיקרוגרם למיליליטר של tricaine.
כדי לחיות בתמונה בחדר hindbrain, בחר את המטרה 20x והגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי ל- 512 על 512 פיקסלים וזום של פי 2.5. כאשר הפרמטרים מיקרוסקופ נקבעו, לרכוש 40 על ידי שלושה מיקרומטר Z-ערימות המשתרעים מן פני השטח הגבי ביותר של hindbrain באמצעות הדמיה דו-ערוצית כדי תמונה ליפוזומים פלואורסצנטי כחול מקרופאגים פלואורסצנטיים ירוקים. כאשר כל התמונות הושגו, לטעון את הקבצים לתוך תוכנה מתאימה לניתוח תמונה 3D.
תחת הכרטיסיה מדידה, גרור את הפרוטוקול חיפוש אובייקטים לשטח גרירת משימות כאן כדי לבצע מדידות. בחרו בערוץ DAPI כדי לסמן את הליפוזומים, וגררו את הכלי בדיקה דרך מקטעי Z כדי לזהות את המקרופאגים עמוסי הליפוזום. לכימות עוצמת הפלואורסצנטיות של ליפוזומים בתאים הבודדים, גררו את הפרוטוקול 'גזור לאזורים מעניינים' למרחב 'גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות', ולהשתמש בכלי מלבן כדי לצייר תיבה מסביב לתא המעניין בממדי X, Y ו- Z.
לאחר מכן בחרו 'צור פריט מדידה' מהתפריט הנפתח 'מדידות' ליצירת קובץ מדידה בחלון הספרייה. בטבלה זו, גודל, פוטנציאל זטה, טעינת סמים, ויעילות מלכודת של ליפוזומים המיוצרים מסוכמים. כפי שנצפה, גודל החלקיק של ליפוזומים דומה עם ובלי טעינת סמים, אם כי מטען פני השטח של ליפוזומים טעונים בסמים הוא קצת יותר ניטרלי מאשר ליפוזומים שליטה עם כחול ימי בלבד.
Microinjection של ליפוזומים בעלי תווית כחולה ימית לתוך החדר האחורי, כפי שהוכח, תוצאות ספיגה מהירה על ידי מקרופאגים תושב כי ניתן לכמת בקלות על ידי מיקרוסקופיה confocal על ידי שלוש שעות לאחר ההזרקה. נויטרופילים, לעומת זאת, הם נצפו לעתים רחוקות להכיל ליפוזומים תאיים. בתוך מקרופאגים עמוסי ליפוזום בודדים, ליפוזומים מצטברים בתוך התאים הפלגוליזומליים, אשר הכרחי עבור השפלה ליפוזום ושחרור תוכן התרופה הבאים לתוך הציטופלסמה.
משלוח לתוך venosus סינוס יכול לספק את הליפוזומים כדי caudal hematopoietic רקמה תושב מקרופאגים דרך זרימת הדם. Microinjection של ליפוזומים טעון עם התרופה מעכבת מינים חמצן מיטוכונדריאלי-תגובתי לתוך החדר האחורי יכול לדכא באופן משמעותי מונוסודיום urate קריסטל מונחה מיטוכונדריה תגובתי מינים של מינים חמצן בתוך מקרופאגים עמוסי ליפוזום hindbrain תושב. אימות נוסף של ההשפעות המדכאות של תרופות מעניינות על מצבי הפעלת מקרופאג יכול להתבצע על ידי חקירת ביטוי גנים ציטוקינים proinflammatory על ידי הר שלם בהכלאה situ ואת הגיוס הזמני של נויטרופילים.
באמצעות טכניקה זו, הצלחנו למקד תרופות מקרופאגים כדי לאשר כי מנגנון immunometabolic מניע את הפעלתם במודל זברה זחל של דלקת דביקה חריפה. הסתגלויות עתידיות של פרוטוקול זה יכולות לכלול ביצוע שינוי פני השטח של ליפוזום כדי לשפר את מיקוד מקרופאג ' או כדי לקדם פילוח לתאי חיסון אחרים, כגון נויטרופילים.
