Лимфоцитная трансмиграция является важной особенностью любого иммунного ответа. Таким образом, этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователю оценить подвижность лимфоцитов в четко определенной системе in vitro. Основным преимуществом этого метода является то, что различные хемокины могут быть оценены, чтобы определить их эффективность индуцирования миграции в недавно определенных клетках, таких как группа 2 врожденных лимфоидных клеток, или ILC2.
Вторым преимуществом является то, что ингибиторы или биологические методы лечения, направленные на блокирование конкретных путей хемокина могут быть проверены с помощью этого метода до выполнения более дорогостоящих экспериментов с животными. Начните с excising легких и селезенки от усыпанных ova-обработанных мышей и женщин используя 2 до 3 животных в группу. Поместите вырезанные ткани в отдельные диссоциацианые трубки в зависимости от типа тканей и пола животных.
Поместите легочную ткань в 500 микролитров средств диссоциации легких в диссоциарной трубке, поместите трубку в автоматизированный диссоциатор ткани и отмежевать ее с помощью протокола легких. Повторите эти шаги в общей сложности два раза. Чтобы разобщить ткани селезенки, поместите его в 500 микролитров полного RPMI сми в диссоциатор, а затем использовать протокол селезенки.
Работая в кабинете биологической безопасности, используя стерильную технику отныне, фильтруйте каждую разобщенной ткани через 40-микрометровый клеточный ситечко и собирайте в 50-миллилитровые конические трубки. Промыть диссоциарные трубки, содержащие гомогенаты легких с пятью миллилитров дополнительных средств диссоциации легких, трубки, содержащие селезенки гомогенатов с пятью миллилитров полного RPMI, и фильтр их содержимое через фильтры, используемые для их соответствующих тканей. Для дальнейшего разобщения легочной ткани, инкубировать легких гомогенатов в течение 15 до 30 минут в 37-градусный инкубатор по Цельсию с 5%углекислого газа.
Затем добавьте пять миллилитров полного RPMI как к гомогенатам легких и селезенки, так и к центрифуге. После отбрасывания супернатанта, объединить гранулы, содержащие спеноциты и клетки легких из группы животных того же пола в одну 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте 10 миллилитров полного RPMI к каждой трубке и повторно посовещение.
Определите общее количество ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек. Отрегулируйте мужские и женские клеточные суспензии до 100 миллионов клеток на миллилитр в буфере разделения, а затем добавьте в пятимиллилитровую полистироловую трубку. После изоляции группы 2 врожденных лимфоидных клеток от 2/3 от общего числа клеток, описанных в рукописи, используйте оставшиеся клетки для cd4-положительной процедуры изоляции Т-клеток.
Чтобы начать CD4-положительную изоляцию Т-клеток, добавьте крысиную сыворотку к подвеске обогащения клеток CD4 T. Затем добавьте изоляционный коктейль в образец клетки и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Вихрь быстрых сфер в течение 30 секунд, и добавить в образец клетки для достижения разбавления 75 микролитров на миллилитр.
Аккуратно перемешать и инкубировать в течение 2 1/2 минут при комнатной температуре. Топ образцов с примерно двумя миллилитров разделения буфера до трех миллилитров, место пятими миллилитров труб в восьмикамерный легкое разделение магнита, и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем наконечник магнит вперед, и пипетка каждой ячейки подвески в чистой пятими миллилитровой трубки.
Добавьте 1,5 миллилитров RPMI без сыворотки в каждую трубку и центрифугу. Слейте супернатант, и resuspend CD4-положительных Т-клеток гранулы на 10 миллионов клеток на миллилитр в сыворотке свободной RPMI. Чтобы начать эту часть протокола, определите количество вставок Transwell, необходимых для эксперимента как для ILC2, так и для CD4-положительных Т-клеток, описанных в рукописи.
Аккуратно переместите трехмирновые вставки Transwell из средних рядов пластины из 24 к началу и нижним рядам той же 24-хорошой пластины с наконечником пипетки и руками в перчатках. Добавьте 500 микролитров миграционных средств массовой информации с CCL17 до 1/3 скважин в среднем ряду пластины из 24 скважин. Добавьте 500 микролитров миграционных средств массовой информации с CCL22 к другим 1/3 скважин.
И, наконец, добавить 500 микролитров сыворотки без RPMI, не содержащие хемокина в последние 1/3 скважин. Этикетка крышки на пластине четко с именем соответствующих трансмиграционных средств массовой информации, размещенных в нижних скважинах. Затем поместите Transwell вставки обратно в скважины, содержащие различные процедуры.
Аккуратно добавьте 100 микролитров клеток CD4 T или ILC2 в верхний колодец каждой вставки, убедившись, что не смешивать или пипетки клеточной подвески вверх и вниз в Transwells. Этикетка крышку на пластине четко с типом ячейки размещены в каждой хорошо, и написать дату и время суток, что клетки были добавлены. Повторите этот процесс, начиная с удаления вставок Transwell с пластины до тех пор, пока все ячейки не будут помещены в вставки Transwell со средствами массовой информации.
После того, как клетки, представляющие интерес изолированы, наиболее важными шагами являются отслеживание хемокинов и типов клеток, которые помещаются в определенные скважины, чтобы аккуратно добавить клетки в верхние камеры, и, наконец, чтобы избежать ненужного контакта с трансмиграционными пластинами во время 48-часовой инкубации. Аккуратно поместите пластину в 37-градусный инкубатор по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и инкубировать в течение 48 часов, убедившись, что свести к минимуму контакт с пластиной в течение инкубации периода. После аккуратного удаления пластины из инкубатора, удалите все вставки Transwell из средних рядов в пустые колодцы чуть выше или ниже.
Соберите ячейки из верхних и нижних колодцев Transwell вставки в трубки помечены сверху или снизу с CCL17, CCL22, или средств массовой информации, с типом ячейки, и с номером репликации. Промыть нижние скважины 500 микролитров 1x PBS, собрать его в соответствующие трубы, и сделать то же самое для верхних скважин. Центрифуга труб при 378 г при комнатной температуре в течение пяти минут.
Используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить все супернатанты, а затем повторно использовать T ячейки и ILC2 гранулы с 50 микролитров 1x PBS. После удаления 10 микролитров клеточной подвески добавьте 90 микролитров 0,4%трипан синего цвета. Подсчитайте ячейки на автоматизированном счетчике ячеек.
И для каждого образца, рекордный процент жизнеспособности и количества клеток на миллилитр, и определить общее количество клеток на лечение в верхней и нижней камере. Когда выражение CCR4 оценивалось как на CD4-положительных Т-клетках, так и на ILC2 по цитометрии потока, не было никаких различий между мужскими и женскими хозяевами. Однако экспрессия CCR4 на клеточной основе на ILC2 была выше по сравнению с CD4-положительными Т-клетками.
Когда нижняя камера аппарата Transwell была заполнена необработанными средствами массовой информации культуры клеток, средствами массовой информации, содержащими CCL22, или средствами массовой информации, содержащими CCL17, менее 14% ячеек мигрировали в условиях контроля мультимедиа. В ответ на CCL22, оба типа клеток, независимо от того, были ли они от мужчин или женщин хозяев, ответил на CCL22. Кроме того, CCL22 индуцированных большую миграцию, чем CCL17 в мужской ILC2.
С другой стороны, CCL17 индуцированных значительную миграцию женских клеток CD4 T и ILC2 по сравнению со средствами массовой информации в одиночку. Лечение CCL17 не отличалось от средств массовой информации для мужских CD4-положительных Т-клеток или мужского ILC2. В неоптимальных условиях, когда пластина с клетками CD4 оставалась при комнатной температуре в течение первых 24 часов, а затем перемещалась в инкубатор, не было никакой миграции в сторону CCL22 и CCL17.
Кроме того, жизнеспособность клеток была особенно низкой для клеток в нижней камере, показывая важность использования правильных температур и условий, описанных в этом протоколе для достижения оптимальных результатов. Как только процедура трансмиграции будет завершена, следует увидеть значительную миграцию в химиокин, представляющий интерес по сравнению с скважинами контроля над средствами массовой информации. Если не наблюдается существенной миграции, можно предположить, что процедура не работает должным образом или что лимфоциты не реагируют на хемокин в вопросе.
Этот метод может быть широко использован для понимания миграции лимфоцитов, когда эти лимфоциты прошли широкий спектр инво лечения.
