La transmigración de linfocitos es una característica importante de cualquier respuesta inmunitaria. Por lo tanto, este protocolo es significativo porque permite a un investigador evaluar la movilidad de los linfocitos en un sistema in vitro bien definido. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden evaluar varias quimioquinas para determinar su eficacia de inducir la migración en células definidas recientemente, como el grupo dos células linfoides innatas, o ILC2.
Una segunda ventaja es que los inhibidores o terapias biológicas destinadas a bloquear determinadas vías de quimiocina pueden ser probados por este método antes de hacer experimentos más caros con animales. Comience por extirpar pulmones y bazos de ratones machos y hembras tratados con ova eutanizado usando de dos a tres animales por grupo. Colocar los tejidos extirpados en tubos de disociación separados según el tipo de tejido y el sexo animal.
Coloque el tejido pulmonar en 500 microlitros de medios de disociación pulmonar en un tubo de disociación pulmonar, coloque el tubo en el disociador automático del tejido y disociarlo utilizando el protocolo pulmonar. Repita estos pasos para un total de dos veces. Para disociar el tejido del bazo, colóquelo en 500 microlitros de medios RPMI completos en el disociador y, a continuación, utilice el protocolo del bazo.
Trabajando en un gabinete de seguridad biológica usando una técnica estéril a partir de ahora, filtra cada tejido disociado a través de un colador celular de 40 micrómetros, y se recoge en tubos cónicos de 50 mililitros. Enjuague los tubos de disociación que contienen homogeneizatos pulmonares con cinco mililitros de medios de disociación pulmonar adicionales, tubos que contengan homogeneizatos de bazo con cinco mililitros de RPMI completa y filtre su contenido a través de los filtros utilizados para sus tejidos correspondientes. Para disociar aún más el tejido pulmonar, incubar homogeneizas pulmonares durante 15 a 30 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Luego agregue cinco mililitros de RPMI completa tanto a los homogeneizas pulmonares como al bazo, y centrifugar. Después de desechar el sobrenadante, combine los pellets que contienen esplenocitos y células pulmonares del grupo de animales del mismo sexo en un solo tubo cónico de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de RPMI completa a cada tubo y resuspend.
Determine el recuento total de celdas mediante un contador de celdas automatizado. Ajustar las suspensiones celulares masculinas y femeninas a 100 millones de células por mililitro en el tampón de separación, y luego añadir a un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Después de aislar el grupo dos células linfoides innatas de 2/3 de las células totales como se describe en el manuscrito, utilice las células restantes para el procedimiento de aislamiento de células T CD4 positivas.
Para iniciar el aislamiento de células T positivas de CD4, agregue suero de rata a la suspensión de enriquecimiento de células T CD4. A continuación, agregue un cóctel de aislamiento a la muestra de célula e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vórtice estilización rápida durante 30 segundos, y añadir a la muestra de la célula para lograr una dilución de 75 microlitros por mililitro.
Mezclar suavemente e incubar durante 2 minutos y medio a temperatura ambiente. Cubra las muestras con aproximadamente dos mililitros de amortiguación de separación de hasta tres mililitros, coloque los tubos de cinco mililitros en el imán de separación fácil de ocho cámaras e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, incline el imán hacia adelante y pipetee cada suspensión de celda en un tubo limpio de cinco mililitros.
Añadir 1,5 mililitros de RPMI sin suero a cada tubo y centrífuga. Verter el sobrenadante, y resuspender el pellet de células T CD4 positivos en 10 millones de células por mililitro en RPMI libre de suero. Para comenzar esta parte del protocolo, determine el número de inserciones de Transwell necesarias para el experimento para las células T ILC2 y CD4 positivas como se describe en el manuscrito.
Mueva suavemente las inserciones Transwell de tres micras de las filas medias de una placa de 24 pozos a las filas superior e inferior de la misma placa de 24 pozos con una punta de pipeta y las manos engu las quemas. Agregue 500 microlitros de medios de migración con CCL17 a 1/3 de los pozos en la fila central de la placa de 24 pozos. Agregue 500 microlitros de medios de migración con CCL22 a otro 1/3 de los pozos.
Y finalmente, añadir 500 microlitros de RPMI libre de suero que no contienen quimiocina hasta el último 1/3 de los pozos. Etiquete claramente la tapa de la placa con el nombre del medio de transmigración apropiado colocado en los pocillos inferiores. A continuación, coloque las inserciones Transwell de nuevo en los pozos que contienen los diversos tratamientos.
Agregue suavemente 100 microlitros de células T CD4 o ILC2 al pozo superior de cada plaquita, asegurándose de no mezclar o pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo en los Transwells. Etiquete la tapa en la placa claramente con el tipo de celda colocado en cada pozo, y escriba la fecha y hora del día en que se agregaron las celdas. Repita este proceso a partir de la eliminación de las inserciones Transwell de la placa hasta que todas las celdas se hayan colocado en inserciones Transwell con medios.
Una vez que las células de interés están aisladas, los pasos más importantes son realizar un seguimiento de las quimioquinas y tipos de células que se colocan en determinados pozos, para agregar suavemente las células a las cámaras superiores, y por último para evitar el contacto innecesario con la placa de transmigración durante la incubación de 48 horas. Coloque suavemente la placa en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, e incubar durante 48 horas, asegurándose de minimizar el contacto con la placa durante el período de incubación. Después de retirar suavemente la placa de la incubadora, retire todas las inserciones transpolís de las filas medias en los pozos vacíos justo encima o por debajo.
Recoja las células de los pozos superior e inferior de las inserciones Transwell en tubos etiquetados con la parte superior o inferior con CCL17, CCL22 o medios, con el tipo de celda, y con el número de réplica. Enjuagar los pozos inferiores con 500 microlitros de 1x PBS, recogerlos en los tubos correspondientes, y hacer lo mismo para los pozos superiores. Centrifugar los tubos a 378 g a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Use una pipeta para eliminar suavemente todo el sobrenadante, y luego resuspend célula T y pellets ILC2 con 50 microlitros de 1x PBS. Después de extraer 10 microlitros de la suspensión celular, agregue 90 microlitros de 0.4%trypan azul. Cuente las celdas en el contador de celdas automatizado.
Y para cada muestra, registre el porcentaje de viabilidad y recuento de células por mililitro, y determine el número total de células por tratamiento en la cámara superior e inferior. Cuando se evaluó la expresión CCR4 tanto en células T CD4 positivas como en ILC2 por citometría de flujo, no hubo diferencias entre los huéspedes masculinos y femeninos. Sin embargo, la expresión de CCR4 por célula en ILC2 fue mayor en comparación con las células T CD4 positivas.
Cuando la cámara inferior del aparato Transwell se llenó con medios de cultivo celular no tratados, medios que contienen CCL22 o medios que contienen CCL17, menos del 14% de las células migraron en condiciones de control de medios. En respuesta a CCL22, ambos tipos de células, independientemente de si eran de huéspedes masculinos o femeninos, respondieron a CCL22. Además, CCL22 indujo una mayor migración que CCL17 en el ILC2 masculino.
Por otro lado, CCL17 indujo una migración significativa de las células T CD4 femeninas y la ILC2 en comparación con los medios por sí solos. El tratamiento con CCL17 no fue diferente de los medios para los ts CD4 positivos masculinos o el ILC2 masculino. En condiciones subóptimas, cuando la placa con células CD4 permaneció a temperatura ambiente durante las primeras 24 horas y luego se trasladó a la incubadora, no hubo migración hacia CCL22 y CCL17.
Además, la viabilidad de las células era notablemente baja para las células de la cámara inferior, mostrando la importancia de utilizar las temperaturas y condiciones correctas descritas en este protocolo para lograr resultados óptimos. Una vez completado el procedimiento de transmigración, uno debe ver una migración significativa a la quimiocina de interés en comparación con los pozos de control de medios. Si no se observa una migración significativa, se puede suponer que el procedimiento no funcionó correctamente o que los linfocitos no responden a la quimiocina en cuestión.
Esta técnica se puede utilizar ampliamente para comprender la migración de linfocitos cuando esos linfocitos han sido sometidos a una amplia gama de tratamientos in vivo.
