Эта система совместной культуры ex vivo может быть использована для определения новых клеточных и молекулярных механизмов миграции клеток глиомы человека и потенциально может быть использована для тестирования эффективности препарата in vitro. Основным преимуществом этого метода является способность изучать взаимодействия между клетками глиобластомы человека и аксонами в режиме реального времени. Демонстрацией процедуры будет Джон Цепецки, аспирант из моей лаборатории.
Чтобы собрать разрозненные блюда культуры, разбавить коллагеновый раствор до 500 микрограмм на миллилитр в стерильной дистиллированной воде и тщательно перемешать. С помощью стерильной трубы передачи заполните 35-миллиметровую культурную тарелку двумя миллилитров разбавленного коллагенового раствора. Затем слегка наклоните блюдо и удалите раствор, оставив тонкую пленку коллагена позади.
Выпределите раствор в следующем 35-миллиметровом блюде. Повторите этот процесс, добавляя больше коллагенового раствора по мере необходимости, пока все блюда не будут покрыты. Для полимеризации коллагена, в ламинарном капюшоне потока, влажные марлевые прокладки с тремя миллилитров концентрированного гидроксида аммония и крышка лотки в течение 15 минут.
Удалите марлевые прокладки и дайте 35-миллиметровой посуде высохнуть. Далее, используйте металлический файл, чтобы подать от точки 18 калибровочных иглы, чтобы сделать тупой кончик. Замочите иглу в 70% этанола для стерилизации.
Нанесите силиконовую смазку на дно разобщеной камеры. Убедитесь, что смазка расположена аккуратно и перекрывается на всех углах. Этот метод может быть очень сложным, поэтому мы предлагаем вам занять дополнительное время, чтобы практиковать применение правильного количества жира перед настройкой разрозненных камер для того, чтобы обеспечить отличный рост.
Также очень важно работать медленно. Настройка больше камер, чем вы думаете, вам нужно, чтобы у вас есть дополнительные услуги, если что-то пойдет не так. Снимите крышку с 35-миллиметровой тарелки, переверните блюдо и поместите царапины на камеру.
Нажмите вниз на дно блюда осторожно с парой типсов. При нанесении смазочных камер на блюдо, не нажмите слишком сильно. В противном случае аксоны не смогут вырасти под ним в соседнюю камеру.
Используйте гемостатические типсы, чтобы аккуратно перевернуть блюдо. Отпустите типсы. Поместите насыпь смазки у основания центральной отсека.
Заполните каждую камеру с дополнительной нейрональной базальной среды. Проверьте наличие утечек и утечки уплотнения с силиконовой смазкой по мере необходимости. Продолжить сборку всех культур блюда и хранить на ночь при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Разрозная камера позволяет использовать различные фармакологические реагенты, а также возможность сравнения и контраста результатов между двумя скважинами на одной пластине. Чтобы посеять подготовленные культуры, содержащие нейросферу GBM, сначала замените среду дополненной NBF, содержащей 10%FBS в каждой дистальной разобщенной камере. Далее, с P20 пипетки установлен на 10 микролитров, сделать один GBM нейросферы из культуры блюдо.
Поместите кончик пипетки в дистальной камере ближе всего к центральной камере, не касаясь аксона и изгнать GBM нейросферы медленно, так что он мягко падает на аксоны. Оставьте культуру в кабинете биобезопасности на один час при комнатной температуре, чтобы позволить нейросфере GBM прикрепиться. Этот метод может быть использован для тестирования фармакологических соединений для лечения опухолей головного мозга.
Этот метод может быть также применен к другим заболеваниям периферической и центральной нервной системы, таким как демиелинизирующий невропатии и рассеянный склероз. В этом протоколе, очищенные аксоны DRG были посеяны с HCGs, которые сформировали двойной положительный GFAP и KI67 опухолевых структур, интегрированных в аксональной сети, указанной красными маркерами опухоли GFAP в то время как отдельные HGCs, выражающие зеленый флуоресцентный белок мигрировали либо в связи или между аксонами. Добавление HGCs на миелинированных DRG олигодендроцитов co-культур показали, что HGCs мигрируют в связи с красными окрашенными миелинированных аксонов и от опухолевой массы через образование псевдоподии.
После того, как этот метод был усовершенствоваен, мы смогли использовать его для изучения миграции стволовых клеток человека ГБМ в режиме реального времени. Мы также смогли изучить влияние на миграцию клеток после добавления новых терапевтических ингибиторов малых молекул. Сфера GBM вторгаясь myelinated олигодендроцит DRG аксон культура показана здесь.
Протокол, описанный здесь, может послужить основой для других биомиметических трехмерных систем ex vivo, предназначенных для оценки последствий новых методов лечения наркомании. Всегда следует проявлять осторожность при обращении с клетками, полученными человеком. Соответствующие СИЗ следует носить и крови патогенов обучение должно быть завершено, чтобы понимаешь риски работы с пациентом производных тканей.
Гидроксид аммония должны быть обработаны с осторожностью, и вы должны носить перчатки, лабораторное пальто, и работать в капюшоне, чтобы предотвратить воздействие этого химического вещества.
