Этот протокол подробно развитие надежных популяций TILLING с высокой частотой мутаций EMS mutagenesis в небольших зерновых культур. Популяции TILLING могут быть использованы для функциональной геномики, а также для форвардного генетического открытия генов в малых зерновых культурах. Популяции TILLING, разработанные с использованием этого метода, имеют высокие частоты мутаций, и этот протокол может быть применен к любому генотипу.
Обнаружение мутаций на основе анализа Cel-1 может быть проведено с использованием основных лабораторных оборудования. Наиболее важным шагом является определение оптимальной концентрации EMS. Таким образом, кривая дозы EMS должна быть сделана специально для отдельной популяции.
Для начала замочите 100 семян с генотипом интереса в каждой из шести 250 миллилитров стеклянных колб, содержащих 50 миллилитров дистиллированной воды. Встряхните при температуре 100 об/мин в течение восьми часов при комнатной температуре для впитывания. Затем, в дымовом капоте, приготовьте 50 миллилитров растворов EMS пяти различных концентраций путем смешивания жидкости EMS и дистиллированной воды.
После впитывания вынюхив воду из пяти колб. Добавьте 50 миллилитров раствора EMS в каждую из пяти колб, содержащих впитываемые семена. Встряхните колбы в течение 16 часов при 75 об/мин и комнатной температуре.
Теперь, decant раствор EMS в пустую бутылку отходов и залить обработанные семена на марлю размещены на пустой бутылке отходов для сбора отдельно для каждой обработки. Используйте дополнительную воду, чтобы помочь заливки семян. Кроме того, спрей несколько миллилитров ЭМС инактивации раствора на стене загрязненных колб.
И погрузить использованные советы пипетки в раствор в течение 24 часов. Неактивный используемый раствор EMS, добавив один том инактивирующего решения EMS для лечения в течение 24 часов. Используя твист галстук, держать EMS обработанные семена внутри марли и мыть под проточной водопроводной водой в течение двух часов.
После мытья, пересадить каждое семя индивидуально в корень тренеров, содержащих заливки почвы. Выращиваем растения при 20-25 градусах Цельсия в течение 16-часового светового периода. После 15 дней трансплантации проверьте растения и подсчитайте количество семян, которые не пророслись.
Запись данных о выживаемости растений. Если выживаемость не в пределах от 40 до 60% провести второй раунд оптимизации дозировки с модифицированной концентрацией до достижения желаемой скорости летальности от 40 до 60% После эксперимента мутагенез, собирать ткани листьев растений M2 в 96 хорошо ткани сбора коробки. Ткань собирается из растений М2, которые были выращены из самостоятельного M1 растений.
Один завод M2 показан с каждого завода M1. Извлекайте ДНК с помощью набора для извлечения ДНК растений с системой очистки ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Затем загрузите два микролитров экстракта ДНК в lv пластины с 16 слотов.
Количественная оценка ДНК с помощью спектрофотометра на длинах волн 260 и 280 нанометров. Разбавить концентрацию ДНК до 25 нанограмм на микролитер без ядра воды. Создайте четыре пула ДНК из 200 микролитров, объединив ДНК из каждой хорошо в четырех блоках 96 хорошо в бассейн пластины при сохранении строки и столбца личности каждого образца.
Далее, подготовить PCR мастер смеси трубки для гена конкретных грунтовки, добавив в каждую трубку ПЦР буфер, вперед и обратно грунтовки, и ДНК-полимеразы в соответствии с рукописью. Aliquot мастер смесь в скважины 96 хорошо ПЦР пластины. Затем добавьте шаблон ДНК.
Загрузите трубки ПЦР в тепловой циклер и используйте профиль приземления для запуска реакции ПЦР на тепловом циклере. Для генерации гетеросоплексов между несовместимыми ДНК инкубируют продукты ПЦР в тепловом циклере в другой программе. Затем добавьте 2,5 микролитров самодельной эндонуклеазы Cel-1 к каждому из гетеросоплексных продуктов ПЦР.
Инкубировать в течение 45 минут при 45 градусах по Цельсию. После этого прекратите реакцию Cel-1, добавив 2,5 микролитера 0,5 молярной ЭДТА при рН восемь. Загрузите 30,5 микролитров каждого обработанного продукта Cel-1, смешанного с пятью микролитров красителя, на гель 3%agarose и запустите на 100 вольт в течение двух с половиной часов.
Чтобы деконвольировать мутантные пулы, определите зигосичность мутантов, запуская две реакции ПЦР для индивидуальной ДНК M2, в которых первая реакция содержит 2,5 микролитров ДНК M2 и 2,5 микролитров ДНК дикого типа, а вторая реакция содержит только пять микролитров ДНК M2. Этот протокол показывает EMS mutagenizing малых зерновых культур и характеристику мутанта. Кривая дозировки указывает на оптимальные дозы EMS для желаемых 50%выживаемости для трех различных видов пшеницы.
Наличие легко идентифицируемых фенотипов в популяции М2 подтверждает эффективность мутагенеза в небольших зерновых популяциях. Вот четыре примера мутантных фенотипов в популяциях M2 TILLING, мутант-альбинос в популяции ячменя M2, мутант хлора в популяции ячменя M2, пестрый мутант с розовым обесцвечиванием в популяции Aegilops tauschii M2 и низкодохвающий мутант в популяции Triticum monococcum M2. Идентификация мутантов с помощью Cel-1 на платформах агарозного геля показывает потенциальный пул мутантов, идентифицированный из 12 мутантных бассейнов уникальными расщепленными полосами.
Деконволюция мутантных бассейнов определила зыготость мутации и помогла отследить мутацию до отдельных образцов. Бассейн A4 имел гетерозиготные мутации, указанные расщепленными полосами в образцах ДНК типа Box 4 и Box 4. Бассейн H5 содержал гомозиготные мутации, так как уникальные расщепленные полосы присутствовали только в образце ДНК дикого типа Box 5 H5.
Наиболее важным шагом является определение оптимальной концентрации EMS для достижения 40 до 60% летальности. После того, как популяция TILLING с высокой частотой мутаций была разработана, она может быть использована для функциональной характеристики любого гена, представляющий интерес. Кроме того, популяция может быть источником полезных генетических вариаций для улучшения урожая.
TILLING широко используется для функциональных геномных исследований в модельных и сельскохозяйственных растениях. Диапазон полученных мутаций может быть промахами, нокаутами, молчаливыми или даже опечатками. EMS является мутагеном.
Поэтому используйте соответствующее средства индивидуальной защиты при обращении с EMS. Обеззараживать остатки растворов и использовать советы пипетки.
