Este protocolo detalha o desenvolvimento de populações robustas de TILLING com alta frequência de mutação pela MUTAGÊNESE EMS em pequenas culturas de grãos. Populações de lavoura podem ser usadas para genômica funcional, bem como para a descoberta de genes do espaço genético avançado em pequenas culturas de grãos. As populações tilling desenvolvidas usando essa técnica têm altas frequências de mutação, e este protocolo pode ser aplicado a qualquer genótipo.
A detecção de mutação baseada em ensaio Cel-1 pode ser conduzida usando equipamentos básicos de laboratório. O passo mais importante é determinar a concentração ótima do EMS. Portanto, uma curva de dosagem emS deve ser feita especificamente para a população individual.
Para começar, mergulhe 100 sementes com o genótipo de interesse em cada um dos seis frascos de vidro de 250 mililitros, contendo 50 mililitros de água destilada. Agite a 100 RPM por oito horas em temperatura ambiente para imbibição. Em seguida, em um capô de fumaça, prepare 50 mililitros de soluções EMS de cinco concentrações diferentes misturando líquido EMS e água destilada.
Após a imbibição, decante a água de cinco frascos. Adicione 50 mililitros de solução EMS em cada um dos cinco frascos contendo sementes absorvidas. Agite os frascos por 16 horas a 75 RPM e temperatura ambiente.
Agora, decante a solução EMS em uma garrafa de lixo vazia e despeje as sementes tratadas em pano de queijo colocado em uma garrafa de lixo vazia para coletar separadamente para cada tratamento. Use água extra para ajudar no derramamento das sementes. Além disso, pulverizar vários mililitros de solução inativante em EMS na parede de frascos contaminados.
E mergulhe as pontas de pipeta usadas na solução por 24 horas. Inativo a solução EMS usada adicionando um volume de solução de ativação EMS para tratar por 24 horas. Usando uma gravata de torção, segure as sementes tratadas em EMS dentro da toalha de queijo e lave sob água da torneira por duas horas.
Após a lavagem, transplante cada semente individualmente em treinadores radiculares contendo solo em vasos. Cultivar plantas a 20 a 25 graus Celsius por um período de luz de 16 horas. Após 15 dias de transplante, verifique as plantas e conte o número de sementes que não conseguiram germinar.
Dados recordes de sobrevivência vegetal. Se a taxa de sobrevivência não estiver dentro de 40 a 60% realizar uma segunda rodada de otimização de dosagem com uma concentração modificada até atingir a taxa de letalidade desejada de 40 a 60% Após o experimento mutagênese, colete o tecido da folha das plantas M2 em uma caixa de coleta de tecido de 96 poços. O tecido é coletado de plantas M2 que foram cultivadas a partir de plantas M1 autoecoladas.
Uma planta M2 é mostrada de cada planta M1. Extrair DNA usando um kit de extração de DNA vegetal com um sistema de purificação de DNA seguindo as recomendações do fabricante. Em seguida, carregue dois microliters do extrato de DNA em placas de LV com 16 ranhuras.
Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro em comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros. Diluir a concentração de DNA para 25 nanogramas por microliter com água livre de nuclease. Crie quatro vezes piscinas de DNA de 200 microliters combinando o DNA de cada poço nos quatro blocos de poço 96 em uma placa de piscina, mantendo a identidade da linha e coluna de cada amostra.
Em seguida, prepare um tubo de mistura mestre pcr para primers específicos de genes adicionando em cada tubo pcr buffer, primers para a frente e reverso, e polimerase de DNA de acordo com o manuscrito. Aliquot a mistura mestre nos poços de uma placa PCR de 96 poços. Em seguida, adicione o modelo de DNA agrupado.
Carregue os tubos PCR em um cicloviário térmico e use um perfil de touchdown para executar a reação do PCR no ciclofaindo térmico. Para gerar heteroduplexos entre DNAs incompatíveis, incubar produtos PCR no ciclor térmico em um programa diferente. Em seguida, adicione 2,5 microliters de endonuclease Cel-1 caseiro a cada um dos produtos PCR heteroduplexos.
Incubar por 45 minutos a 45 graus Celsius. Depois disso, termine a reação cel-1 adicionando 2,5 microliters de 0,5 molar EDTA em pH oito. Carregue 30,5 microliters de cada produto tratado Cel-1 misturado com cinco microliters de corante em um gel de 3%agarose e execute a 100 volts por duas horas e meia.
Para desconvolucer piscinas mutantes, determine a zigosidade dos mutantes executando duas reações pcr para DNA M2 individual em que a primeira reação contém 2,5 microliters de DNA M2 e 2,5 microliters de DNA tipo selvagem e a segunda reação contém apenas cinco microliters de DNA M2. Este protocolo mostra a EMS mutagenizando pequenas culturas de grãos e a caracterização de mutantes. A curva de dosagem indica ótimas doses de EMS para as taxas de sobrevivência desejadas de 50% para três espécies diferentes de trigo.
A presença de fenótipos facilmente identificáveis na população M2 confirma a eficácia da mutagênese em pequenas populações de grãos. Aqui estão quatro exemplos dos fenótipos mutantes em populações M2 TILLING, um mutante albino em uma população de cevada M2, um mutante de cloro em uma população de cevada M2, um mutante variegated com descoloração rosa em uma população de Aegilops tauschii M2, e um mutante de baixa lavoura em uma população de Triticum monococcum M2. Uma identificação mutante usando Cel-1 em plataformas de gel de agarose mostra uma potencial piscina mutante identificada entre 12 piscinas mutantes por bandas únicas.
A desconvolução de piscinas mutantes determinou a zigosidade da mutação e ajudou a rastrear a mutação até amostras individuais. A piscina A4 tinha mutações heterozigous, indicadas por bandas cortadas em amostras de DNA do tipo selvagem Caixa 4 e Box 4. A piscina H5 continha mutações homozigosas, pois bandas únicas de fenda só estavam presentes na amostra de DNA tipo selvagem box 5 H5.
O passo mais importante é determinar a concentração ideal do EMS para atingir a taxa de letalidade de 40 a 60%. Uma vez que uma população de TILLING com alta frequência de mutação tenha sido desenvolvida, ela pode ser usada para caracterização funcional de qualquer gene de interesse. Além disso, a população pode ser uma fonte de variação genética útil para o melhoramento das culturas.
O TILLING tem sido amplamente utilizado para estudos genômicos funcionais em plantas de modelo e cultura. A gama de mutações obtidas pode ser erros, nocautes, formas silenciosas ou até mesmo mal-anotados. EMS é um mutagênico.
Portanto, use equipamentos de proteção individual adequados enquanto manuseia o EMS. Descontaminar as sobras e usar dicas de pipeta.
