이 프로토콜은 작은 곡물 작물에서 EMS 돌연변이 발생에 의해 높은 돌연변이 주파수를 가진 강력한 틸링 인구의 발달을 상세히 설명합니다. 경유 인구는 기능적 유전체학뿐만 아니라 작은 곡물 작물에서 유전자 유전자 발견을 위해 사용될 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 개발된 틸링 인구는 높은 돌연변이 주파수를 가지며,이 프로토콜은 모든 유전자형에 적용 될 수있다.
Cel-1 분석 기반 돌연변이 검출은 기본 실험실 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 가장 중요한 단계는 최적의 EMS 농도를 결정하는 것입니다. 따라서, EMS 투여량 곡선은 개별 집단을 위해 특별히 이루어져야 한다.
우선, 증류수 50밀리리터를 함유한 6개의 250밀리리터 유리 플라스크에 관심 있는 유전자형으로 100개의 씨앗을 담급니다. 실온에서 8시간 동안 100 RPM에서 흔들어 서 비비티온을 만드시면 됩니다. 그런 다음 연기 후드에서 EMS 액체와 증류수를 혼합하여 5가지 농도의 EMS 용액 50 밀리리터를 준비합니다.
imbibition 후, 다섯 플라스크에서 물을 디게. 임비브 씨앗을 포함하는 5개의 플라스크 각각에 50밀리리터의 EMS 용액을 추가합니다. 75 RPM 및 실온에서 16 시간 동안 플라스크를 흔들어보십시오.
이제 EMS 용액을 빈 폐기물 병에 넣고 처리된 씨앗을 빈 폐기물 병에 넣은 치즈 천에 부어 각 처리에 대해 별도로 수집합니다. 씨앗을 붓는 데 도움이 여분의 물을 사용합니다. 또한 오염된 플라스크 벽에 EMS 비활성화 용액을 여러 밀리리터로 분사합니다.
또한 24시간 동안 사용된 파이펫 팁을 솔루션에 담그십시오. 24시간 동안 치료할 EMS 비활성화 솔루션 의 1부량을 추가하여 사용된 EMS 솔루션을 비활성 상태로 처리합니다. 트위스트 넥타이를 사용하여 EMS 처리 씨앗을 치즈 보안에 들고 흐르는 수돗물 아래에서 2 시간 동안 씻습니다.
세척 후 각 씨앗을 포팅 토양을 포함하는 루트 트레이너로 개별적으로 이식합니다. 16 시간 광 기간 동안 20 ~ 25도에서 식물을 성장. 이식 15 일 후, 식물을 확인하고 발아에 실패 씨앗의 수를 계산합니다.
식물 생존의 기록을 기록합니다. 생존율이 40~60% 이내인 경우 돌연변이 발생 실험 후 40~60%의 바람직한 치사율을 달성하기 전까지 수정된 농도로 제2투여 최적화를 실시하면 96개의 잘 조직 수집 상자에서 M2 식물의 잎 조직을 수집한다. 조직은 자아 M1 식물에서 재배 된 M2 식물에서 수집됩니다.
각 M1 공장에서 하나의 M2 플랜트가 표시됩니다. 제조업체의 권고에 따라 DNA 정제 시스템을 갖춘 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 그런 다음 16개의 슬롯이 있는 LV 플레이트에 DNA 추출물의 마이크로리터 2개를 적재합니다.
260 나노미터및 280 나노미터의 파장에서 분광계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 핵증이 없는 물로 마이크로리터당 DNA 농도를 25나노그램으로 희석시킵니다. 각 샘플의 행 및 컬럼 ID를 유지하면서 4개의 96웰 블록에서 각 우물의 DNA를 풀 플레이트로 결합하여 200 마이크로리터의 4배 의 DNA 풀을 만듭니다.
다음으로, 원고에 따라 각 튜브 PCR 버퍼, 전방 및 역 프라이머 및 DNA 폴리머라제에 첨가하여 유전자 특이적 프라이머에 대한 PCR 마스터 믹스 튜브를 준비한다. 96 잘 PCR 플레이트의 우물에 마스터 믹스를 알리 쿼트. 그런 다음 풀이 된 DNA 템플릿을 추가합니다.
PCR 튜브를 열 사이클러에 로드하고 터치 다운 프로파일을 사용하여 열 사이클러에서 PCR 반응을 실행합니다. 일치하지 않는 DN사이에 이테로두플렉스를 생성하려면 다른 프로그램에서 열 사이클러에서 PCR 제품을 배양합니다. 그런 다음 각 헤테로두플렉스 PCR 제품에 2.5 마이크로리터의 수제 Cel-1 엔도누셀을 추가합니다.
섭씨 45도에서 45분 동안 배양하세요. 그 후, pH 8에서 0.5 어어 EDTA의 2.5 마이크로리터를 추가하여 Cel-1 반응을 종료합니다. 각 Cel-1 처리 된 제품의 30.5 마이크로 리터를 3 % 아가로즈 젤에 5 마이크로 리터와 혼합하고 2 시간 반 동안 100 볼트에서 실행합니다.
돌연변이 풀을 감소시키기 위해, 첫 번째 반응이 M2 DNA의 2.5 마이크로리터와 2.5 마이크로리터의 야생 형 DNA를 포함하고 두 번째 반응이 M2 DNA의 5 마이크로 리터를 포함하는 개별 M2 DNA에 대한 두 개의 PCR 반응을 실행하여 돌연변이의 zygosity를 결정한다. 이 프로토콜은 작은 곡물 작물의 EMS 돌연변이와 돌연변이의 특성을 보여줍니다. 투여 곡선은 밀의 세 가지 다른 종에 대한 원하는 50 %의 생존율에 대한 최적의 EMS 용량을 나타냅니다.
M2 인구에서 쉽게 식별 가능한 표현형의 존재는 작은 곡물 인구에서 돌연변이 발생의 효과를 확인합니다. 다음은 M2 틸링 인구에서 돌연변이 표현형의 네 가지 예, 보리 M2 인구의 알비노 돌연변이, 보리 M2 인구의 염소 돌연변이, Aegilops tauschii M2 인구에서 분홍색 변색을 가진 변종 돌연변이, 그리고 트리코 모집단에서 낮은 틸러 돌연변이의 네 가지 예입니다. 아가로즈 젤 플랫폼에서 Cel-1을 사용하는 돌연변이 식별은 독특한 절단 밴드에 의해 12개의 돌연변이 풀 중에서 확인된 잠재적인 돌연변이 풀을 보여줍니다.
돌연변이 풀의 감소는 돌연변이의 zygosity를 결정하고 개별 견본에 돌연변이를 추적하는 것을 도왔습니다. A4 풀은 상자 4와 상자 4 야생 형 DNA 샘플 모두에서 칼 밴드로 표시된 이종성 돌연변이를 가지고 있었습니다. H5 풀은 독특한 칼 밴드가 Box 5 H5 야생 형 DNA 샘플에만 존재했기 때문에 동종 가성 돌연변이를 포함했다.
가장 중요한 단계는 40~60%의 치사율을 달성하기 위해 EMS의 최적 농도를 결정하는 것입니다. 일단 높은 돌연변이 주파수를 가진 틸링 인구가 개발되면 관심있는 임의의 유전자의 기능적 특성화에 사용될 수 있다. 추가적으로, 인구는 작물 개선을 위한 유용한 유전 변이의 근원일 수 있습니다.
틸링은 모델 및 작물 식물의 기능적 게놈 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 얻어진 돌연변이의 범위는 오해의 소지가 있을 수 있습니다, 녹아웃, 침묵, 또는 심지어 놓친 양식. EMS는 돌연변이원입니다.
따라서 EMS를 취급하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. 남은 용액을 오염 제거하고 파이펫 팁을 사용했습니다.
