Эта методология позволяет количественно оценить химиотаксическую активность моноцитов крови у живых животных и изучить влияние плохого питания на функцию моноцитов и их основные механизмы. Макрофаги, полученные из моноцитов, могут быть изолированы и проанализированы с использованием различных подходов, включая одноклеточные и омичи, которые обеспечивают снимок состояния моноцитов крови в моделях мышей. Сегодняшняя процедура будет проведена доктором Янг Чжу Ан доцентом в моей лаборатории, и доктором Luxi Wang, постдоком в моей лаборатории.
Перед началом процедуры очистите вытяжку клеточной культуры дезинфицирующим средством и полностью оттаив на льду раствор, уменьшенный с помощью фактора роста. Оборудовать отдельные стерильные один миллилитр шприцы с 26 игл калибра и место иглы на льду. После того, как раствор оттаял, протрите верхнюю часть оболочки подвала мембраны полученных раствор флакон с спиртом тампоном перед загрузкой 500 микролитров раствора, дополненного или без химио-притязатель в каждый миллилитр шприц.
Затем удалите любые пузырьки воздуха из подвала мембраны полученных раствор загружен шприц для обеспечения равномерного образования вилки. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, медленно вводить весь объем подвала мембраны полученных раствор без MCP-1 добавил около 100 микролитров в секунду подкожно в правый фланг обезболивающей мыши. А целых 500 микролитров раствора, полученного из мембраны, дополнили MCP-1 левым флангом животного.
Держите шприц на месте от 20 до 30 секунд после инъекции, чтобы предотвратить утечку раствора и позволить одной гладкой вилке геля сформировать перед размещением мыши на нагревание площадку с мониторингом до полного восстановления. Через три дня после инъекции, удалить спинные волосы из плагина вводили животных и использовать миппы, чтобы схватить кожу вокруг нижней грудной и верхней поясничного позвонка. Сделайте двухмиллиметровый разрез в кожу и разрежьте вдоль средней линии задней части мыши от шейных позвонков до одного сантиметра над стыком позвонков.
Отделить кожу от мышечного слоя и приколоть кожу на платформе полистирола пены. Далее, под рассечением микроскопа, тщательно понять волокнистую капсулу, которая содержит мембрану подвала полученных гель штепс и использовать тонкие миппы для удаления волокнистой капсулы. Затем используйте тонкие ножницы для очистки вилки.
Затем перенесите очищенную мембрану подвала, полученную из геля, в соответствующую помеченную и взвешенную 1,5 миллилитровую микро центрифугу. Reweigh трубки для расчета веса подвала мембраны полученных гель штепсельной вилки. Для подвала мембраны полученных гель плагин пищеварения, использовать чистые тонкие ножницы, чтобы фарш подвале мембраны полученных гель плагин в каждой микро центрифуги трубки и добавить 800 микро литров вытеснить в пробки.
Vortex на максимальной скорости в течение 10 секунд, чтобы нарушить пробки и место микро центрифуги труб на 37 градусов по Цельсию в течение двух часов в термомишалке на 1400 оборотов в минуту, чтобы полностью растворить подвале мембраны полученных гелевых пробок. В конце инкубации осадочные фрагменты штепсельной вилки по центрифуге два раза и повторное использование гранул в 300 микролитров PBS. Перенесите 50 микролитров каждой клеточной суспензии в новые микро центрифуги и обозначите клетки в новых трубках 0,5 микролитров кальцина.
После 10-минутной инкубации при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе углекислого газа подсчитайте количество живых зеленых флуоресцентных ламп положительные и мертвые нефлуоресцентные клетки на автоматизированном счетчике клеток. Для анализа одноклеточной западной помарки добавьте один миллилитр разбавленной одноклеточной суспензии к регидратированной одноклеточной западной помарке в нижней части 10-сантиметровой чашки Петри. Через 5-15 минут осмотрим чип под микроскопией яркого поля.
Приблизительно от 15 до 20% микро скважин должны быть заняты одной ячейкой и менее двух процентов скважин должны содержать две или более ячеек. Если чип был правильно загружен, наклоните блюдо на 45 градусов и помойте чип три раза буфером подвески, чтобы удалить любые незахватанные клетки. После последней стирки, тщательно и загрузить чип в ячейку электрофорез одной клетки западного инструмента, гель-стороны вверх, и покрыть всю одну ячейку западной помарки чип с лизом работает буфер.
Инициировать лиз клетки и запустить инструмент в соответствии с соответствующими параметрами эксперимента. В конце пробега, промыть чип с двумя 10-минутные моет со свежим буфером стирки на стирку при комнатной температуре. После второй стирки добавьте 80 микролитров первичного раствора антитела, представляющих интерес для зондирующего камеры антитела, и опустите чип гель-стороной вниз так, чтобы фитиль раствора антитела поперек чипа.
После двух часов при комнатной температуре, мыть чип три раза в стиральный буфер и один раз в воде на шейкере. Инкубировать чип с соответствующим вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть чип три раза с стиральный буфер и спина чип на слайд спиннер, чтобы удалить все оставшиеся стиральный буфер.
Чтобы лишить одноклеточный западный чип пятно, поместите 15 миллилитров трубки стойку в 60 градусов по Цельсию водяной бане с водой всего на один сантиметр выше стойки. В дымовой капот добавьте в канистру 40 миллилитров зачистки буфера и 320 микролитров бета-морцептового этанола. Поместите чип в 10-сантиметровую чашку Петри внутри канистры и запечатав канистру с помощью Parafilm.
Затем поместите канистру внутри трубки стойку в водяной бане. После 90 минут, тщательно передать чип в новую чашку Петри и кратко мыть чип один раз с мыть буфера, прежде чем добавить 15 миллилитров свежего буфера стирки в чашку Петри в течение 15 минут мыть на шейкере. В этом репрезентативном эксперименте, клетки, набранные в каждую вилку были подсчитаны на один, три и пять дней после инъекции.
Путем вычитать отсчет клетки в корабля-нагруженных штепсельной вилке от отсчета клетки в mcP-1 нагруженных штепсельной вилке, число клеток специфически завербованных в ответ на привлекающий химиотерапию после этого было высчитано. В течение пятидневного периода наблюдался ускоренный набор и накопление клеток MCP-1, при этом показатели возрастали с 31 000 клеток в день после одного дня инъекций до 136 000 клеток в день, через пять дней после инъекции. Одноклеточный западный анализ помарки после этого был использован для того чтобы определить по-разному типы клетки завербованные к штепсельной вилке мембраны подвала-производным, согласно их выражению специфических маркеров иммунной клетки интереса.
Например, процент моноцитов в MCP-1 загружен подвале мембраны полученных гелеобразуется был низким в первый день и достиг пика в третий день, прежде чем снижается снова на пятый день, в то время как макрофаг номера неуклонно увеличивается на протяжении всего периода исследования. Для MCP-1 загруженных штепсельной вилки, процент моноцитов плюс макрофаги в изолированной популяции клеток был самым высоким на третий день, что свидетельствует о том, что через три дня, подавляющее большинство клеток, набранных MCP-1 зависимых хемотаксис были моноциты и макрофаги. Несмотря на то, что общее количество моноцитов плюс макрофаги, как правило, выше на пятый день по сравнению с тремя днями, количество клеток на третий день более точно отражает периферическую кровь моноцитов хемотаксиса и набора, и поэтому третий день рекомендуется для подвала мембраны прямого плагина анализов.
Успешное приобретение одиночных ячеек для анализа ниже по течению зависит от точности впрыска и полного удаления пробок. Цитометрия потока, одноклеточный западный blotting, навалом, или одноклеточной РНК секвенирования и других омиков процедуры могут быть использованы для оценки характерных и фенотипов набранных моноцитов и моноцитов полученных макрофагов.
