Esta metodología nos permite cuantificar la actividad quimiotáctica del monocitos sanguíneos en animales vivos y estudiar el efecto de las dietas deficientes en la función monócita y sus mecanismos subyacentes. Los macrófagos derivados de monocitos se pueden aislar y analizar utilizando varios enfoques, incluyendo una sola célula, y técnicas de ómica que proporcionan una instantánea de la salud del sitio de monocitos sanguíneos en modelos de ratón. El procedimiento de hoy será llevado a cabo por el Dr. Young Joo Ahn profesor asistente en mi laboratorio, y el Dr. Luxi Wang, un postdoctorado en mi laboratorio.
Antes de comenzar el procedimiento, limpie la campana de cultivo celular con desinfectante y descongele completamente la solución derivada de la membrana del sótano reducida en el factor de crecimiento en hielo. Equipe jeringas estériles individuales de un mililitro con agujas de calibre 26 y coloque las agujas sobre hielo. Una vez descongelada la solución, limpie la parte superior del vial de solución derivado de la membrana del sótano con un hisopo de alcohol antes de cargar 500 micro litros de solución complementados con o sin químico atractivo en cada jeringa de un mililitro.
A continuación, retire las burbujas de aire de la jeringa cargada con solución derivada de membrana del sótano para garantizar una formación uniforme de tapones. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, inyecte lentamente un volumen entero de solución derivada de la membrana del sótano sin MCP-1 añadido a aproximadamente 100 micro litros por segundo por segundo por vía subcutánea en el flanco derecho del ratón anestesiado. Y los 500 micro litros enteros de solución derivada de membrana del sótano complementados con MCP-1 en el flanco izquierdo del animal.
Sostenga la jeringa en su lugar 20 a 30 segundos después de la inyección para evitar fugas de la solución y para permitir que se forme un único tapón de gel liso antes de colocar el ratón en una almohadilla de calentamiento con supervisión hasta la recuperación completa. Tres días después de la inyección, retire el vello dorsal de un animal inyectado enchufado y use fórceps para agarrar la piel alrededor de la vértebra lumbar torácica y superior inferior. Haga una incisión de dos milímetros de largo en la piel y corte a lo largo de la línea media de la parte posterior del ratón desde las vértebras cervicales hasta un centímetro por encima de la unión vertebral del mido.
Separa la piel de la capa muscular y ancla la piel sobre una plataforma de espuma de poliestireno. A continuación, bajo un microscopio de disección, agarre cuidadosamente la cápsula fibrosa que contiene el tapón de gel derivado de la membrana del sótano y utilice fórceps finos para eliminar la cápsula fibrosa. A continuación, utilice tijeras finas para limpiar el enchufe.
A continuación, transfiera el tapón de gel derivado de membrana del sótano limpio a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros debidamente etiquetado y pesado. Vuelva a pesar el tubo para calcular el peso del tapón de gel derivado de la membrana del sótano. Para la digestión del tapón de gel derivado de la membrana del sótano, utilice tijeras finas limpias para picar el tapón de gel derivado de la membrana del sótano en cada tubo de micro centrífuga y agregue 800 micro litros de desplazamiento a los tapones.
Vórtice a la velocidad máxima durante 10 segundos para interrumpir los tapones y colocar los tubos de micro centrífuga a 37 grados Celsius durante dos horas en un mezclador térmico a 1400 rotaciones por minuto para disolver completamente los tapones de gel derivados de la membrana del sótano. Al final de la incubación, sedimentar el tapón fragmenta por centrifugación dos veces y resuspend los pellets en 300 microlitros de PBS. Transfiera 50 microlitros de cada suspensión celular a nuevos tubos de micro centrífuga y etiquete las células en los nuevos tubos con 0,5 microlitros de calcina.
Después de una incubación de 10 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono, cuente el número de células fluorescentes verdes vivas positivas y no fluorescentes muertas en un contador de células automatizado. Para un análisis de western blot de una sola célula, agregue un mililitro de suspensión de una sola célula diluida a un chip de mancha occidental de una sola célula rehidracionado en la parte inferior de un plato de petri de 10 centímetros. Después de cinco a 15 minutos, examine el chip bajo microscopía de campo brillante.
Aproximadamente del 15 al 20% de los micro pozos deben estar ocupados por una sola célula y menos del dos por ciento de los pozos deben contener dos o más células. Si el chip se ha cargado correctamente, incline el plato 45 grados y lave el chip tres veces con tampón de suspensión para eliminar las células no capturadas. Después del último lavado, cuidadosamente y cargue el chip en la célula de electroforesis de un instrumento occidental de una sola célula, gel-lado hacia arriba, y cubrir toda la sola célula western blot chip con tampón de lysis running.
Inicie la lelisis de celda y ejecute el instrumento de acuerdo con los parámetros de experimento adecuados. Al final de la carrera, enjuague el chip con dos lavados de 10 minutos con tampón de lavado fresco por lavado a temperatura ambiente. Después del segundo lavado, agregue 80 microlitros de la solución de anticuerpos primarios de interés para la cámara de sondeo de anticuerpos y baje el lado del gel del chip hacia abajo para que la solución de anticuerpos se mecha a través del chip.
Después de dos horas a temperatura ambiente, lave el chip tres veces en el tampón de lavado y una vez en agua en una coctelera. Incubar el chip con un anticuerpo secundario adecuado durante una hora a temperatura ambiente protegido de la luz. Al final de la incubación, lave el chip tres veces con el tampón de lavado y gire el chip en un spinner deslizante para eliminar cualquier tampón de lavado restante.
Para despojar el chip de la mancha occidental de una sola célula, coloque un estante de tubo de 15 mililitros en un baño de agua de 60 grados Celsius con el agua justo un centímetro por encima del estante. En una campana de humo, agregue 40 mililitros de tampón de desmontaje y 320 microlitros de etanol beta morcepta a un recipiente. Coloque el chip en un plato de petri de 10 centímetros dentro del recipiente y selle el recipiente con Parafilm.
A continuación, coloque el recipiente dentro del estante del tubo en el baño de agua. Después de 90 minutos, transfiera cuidadosamente el chip a una nueva placa de petri y lave brevemente el chip una vez con tampón de lavado antes de agregar 15 mililitros de tampón de lavado fresco a la placa de petri para un lavado de 15 minutos en la coctelera. En este experimento representativo, las células reclutadas en cada enchufe se contaron a los uno, tres y cinco días después de la inyección.
Al restar el recuento de celdas en los tapones cargados por el vehículo del recuento de celdas en los enchufes cargados MCP-1, se calculó el número de celdas reclutadas específicamente en respuesta al atractor de quimio. Durante el período de cinco días se observó un reclutamiento y acumulación de células específicos de MCP-1 acelerados durante el período de cinco días, con tasas que aumentaron de 31.000 células al día después de un día de inyección a hasta 136.000 células por día, cinco días después de la inyección. El análisis de la mancha occidental de una sola célula se utilizó entonces para identificar los diferentes tipos de células reclutadas para los tapones derivados de la membrana del sótano, de acuerdo con su expresión de marcadores específicos de células inmunitarias de interés.
Por ejemplo, el porcentaje de monocitos dentro de los tapones de gel derivados de membrana del sótano cargados de MCP-1 fue bajo en el primer día y alcanzó su punto máximo en el día tres antes de caer de nuevo en el día cinco, mientras que el número de macrófagos aumentó constantemente durante todo el período de estudio. Para los tapones cargados con MCP-1, el porcentaje de monocitos más macrófagos dentro de la población celular aislada era más alto en el tercer día, lo que indica que después de tres días, la gran mayoría de las células reclutadas por quimiotaxis dependientes de MCP-1 eran monocitos y macrófagos. A pesar de que el número total de monocitos más macrófagos suele ser mayor en el día cinco en comparación con el tercer día, el recuento de células en el tercer día refleja con mayor precisión la sangre periférica de la quimiotaxis de monocitos y el reclutamiento, y por lo tanto se recomienda el tercer día para los análisis de enchufes directos de membrana del sótano.
La adquisición exitosa de células individuales para el análisis posterior depende de la precisión de la inyección y de la eliminación completa de los tapones. La citometría de flujo, la hinchazón occidental de una sola célula, la secuenciación de ARN a granel o de una sola célula y otros procedimientos de omics se pueden utilizar para evaluar las características y los fenotipos de los macrófagos derivados de monocitos y monocitos reclutados.
