Значение этого протокола заключается в использовании нового флуоресцентного белка SUMO-ловушки UTAG для обнаружения белкового модификатора SUMO в различных эукариотических клетках. Основным преимуществом этого метода является простой протокол для обнаружения SUMO без антител в различных клетках, включая культуру тканей млекопитающих и нематодные гонады. SUMO играет важную роль в раковых и нейродегенеративных расстройствах, и это подчеркивает необходимость надежных и надежных инструментов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков.
Поскольку SUMO очень сохраняется, флуоресцентный белок UTAG, улавливАющий SUMO, может быть использован для обозначения конъюгированных СУМО во многих различных организмах. Это видео демонстрирует его использование в клетках млекопитающих. Кроме того, полный текст описывает его использование в нематодных ооцитах.
Визуальная демонстрация этого метода дает критические подсказки для лечения клеток до окрашивания и обнаружения СУМО. Для начала вырастите клетки культуры тканей выбора на 22-миллиметровой круглой крышке скользит в шести-хорошо TC пластин до 70 до 80% стечения. Вымойте клетки кратко с одним миллилитров DPBS.
Чтобы исправить клетки, добавьте два миллилитров свежих 4%PFA и DPBS к каждому хорошо. Инкубировать клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные клетки три раза в течение пяти минут в один миллилитр DPBS при гайке пластины.
Чтобы пронизать клетки, инкубировать в течение 15 минут с 1%Triton X-100 в DPBS. Вымойте клетки снова, как и раньше. Инкубировать клетки с 500 микролитров 1 молярного глицина HCL pH 2 в течение 10 секунд.
Затем немедленно нейтрализуем рН с помощью 500 микролитров буфера 10X SUMO Protease или SPB. После мытья клеток, как и прежде, удалить крышку скользит из дома и поместить их в камеру влажности. Только для окрашивания UTAG-FL смешайте один микрограмм UTAG-FL со 100 микролитров 1X SPB, содержащими пять миллимоляров TCEP в трубке.
Затем, пипетка смесь на клетки на крышке скольжения и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа в камере влажности. Чтобы вымыть крышку скользит, пипетка 200 микролитров DPBS на каждой крышке скольжения и оставить на месте в течение 10 минут. Повторите стирку еще два раза.
Удалите крышку скользит от последней стирки и инвертировать на предварительно очищенные микроскопии слайд с каплей монтажа среды. Храните образцы на ночь в морозильной камере 20 градусов по Цельсию перед просмотром под микроскопом. Визуализуйте ячейки с помощью соответствующих наборов фильтров для DAPI и Texas Red.
Пожалуйста, смотрите полный текст протокола о том, как маркировать SUMO и фиксированные нематодные гонады. Хотя маркировка клеток млекопитающих довольно проста, маркировка нематодных яйцеклеток требует предварительной подготовки в гонадных вскрытиях. KmUTAG-FL, инкубированный фиксированными клетками PMT2, показал отчетливое ядерное окрашивание.
Были видны как диффузные ядерные окрашивания, так и различные ядерные очаги. Ядерная локализация была подтверждена с использованием совместного окрашивания с DAPI. В соответствии с деятельностью СУМО по захвату Кмутаг-FL, модель локализации ядерного оружия напоминала окрашивание SUMO23.
Совместное окрашивание анти-SUMO23 8A2 антителом подтвердило коа локализацию KmUTAG-FL с сигналом SUMO23. Это подтверждает эффективность KmUTAG-FL для обнаружения SUMO23 в клетках млекопитающих. Изолированные гонады от яйцеклеток, производящих взрослый гермафродит c.
нематоды elegans были помечены антителами против СУМО. В соответствии с предыдущими докладами, антитела против СУМО первоначально локализованы в ядерной плазме поздних миотических ооцитов профазы. Затем он перераспределялся в центральный кольцевой комплекс парных омологов, когда ядерный конверт сломался и хромосомы примыкались к метафазной пластине.
Параллельно с подготовкой гонады, помеченные kmUTAG-FL, выявили аналогичные закономерности. KmUTAG-FL перешла от маркировки нуклеоплазмы к концентрации на кольцевом комплексе, как яйцеклетки начали и завершили процесс распада ядерного конверта. Эти результаты подтверждают KmUTAG-FL в качестве полезного инструмента для анализа миоза и процессов, связанных с СУМО в c.
elegans и, возможно, другие нематоды. При выполнении фиксации крайне важно использовать свежий параформальдегид и короткое время фиксации, чтобы сохранить СУМО в штатном состоянии, чтобы его можно было распознать в КмУТАГ. Поскольку третичная структура SUMO очень сохраняется, весьма вероятно, что варианты SUMO из дополнительных модельных и не моделных систем могут быть проанализированы с помощью реагента KmUTAG-FL.
В настоящее время мы используем этот роман флуоресцентных SUMO-ловушки UTAG белка для изучения функции СУМО во время клеточного стресса. Наконец, обратите внимание, что все шаги с использованием фиксаторного параформальдегида должны выполняться в лабораторном защитном капюшоне, и этот реагент должен быть утилизирован должным образом.
