המשמעות של פרוטוקול זה היא השימוש בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני לוכדת SUMO לגילוי של מכפיל החלבון SUMO בתאים אוקריוטיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרוטוקול פשוט לגילוי ללא נוגדנים של SUMO במגוון תאים, כולל תרבות רקמת יונקים וגונדס נמטודה. SUMO ממלא תפקידים חשובים בסרטן ובהפרעות ניווניות, וזה מדגיש את הצורך בכלים חזקים ואמינים לגילוי וניתוח תפקודי של חלבונים ששונו על ידי SUMO.
מכיוון ש-SUMO שמור מאוד, ניתן להשתמש בחלבון UTAG לוכד הסומו הפלואורסצנטי כדי לסמן סומו נדוש באורגניזמים רבים ושונים. סרטון זה מדגים את השימוש בו בתאי יונקים. בנוסף, הטקסט המלא מתאר את השימוש בו בוציטים nematode.
ההדגמה החזותית של טכניקה זו מספקת רמזים קריטיים לטיפול בתאים לפני הכתמות וזיהוי SUMO. כדי להתחיל, לגדל תאים תרבות רקמות של בחירה על 22 מילימטר עגול כיסוי מחליק שש בארות TC צלחות עד 70 עד 80% confluent. לשטוף את התאים לזמן קצר עם מיליליטר אחד של DPBS.
כדי לתקן את התאים, הוסף שני מיליליטר של 4%PFA ו- DPBS טריים לכל באר. דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים במשך חמש דקות במיליליטר אחד של DPBS תוך כדי אגוזים את הצלחת.
כדי לחלחל לתאים, דגירה במשך 15 דקות עם 1%Triton X-100 ב- DPBS. לשטוף את התאים שוב, כמו קודם. הדגירה את התאים עם 500 microliters של 1 טוחן גליצין HCL pH 2 במשך 10 שניות.
לאחר מכן לנטרל את ה- pH מיד עם 500 microliters של מאגר פרוטאז סומו 10X, או SPB. לאחר שטיפת התאים כמו קודם, להסיר את החלקות המכסה מן הטוב ולמקם אותם בתא לחות. עבור כתמי UTAG-FL בלבד, יש לערבב מיקרוגרם אחד של UTAG-FL עם 100 מיקרוליטרים של 1X SPB המכילים 5 מילימולרים TCEP בצינור.
לאחר מכן, פיפטה לערבב על התאים על להחליק את הכיסוי דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה בתא הלחות. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, פיפטה 200 microliters של DPBS על כל להחליק כיסוי ולהשאיר במקום במשך 10 דקות. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
הסר את החלקות המכסה מהכביסה האחרונה והתהפך על מגלשת מיקרוסקופיה מנוקה מראש עם טיפת מדיום הרכבה. לאחסן את הדגימות לילה במקפיא 20 מעלות צלזיוס לפני הצפייה מתחת למיקרוסקופ. הצג את התאים באופן חזותי באמצעות ערכות המסננים המתאימות עבור DAPI ו- Texas Red.
נא עיין בטקסט המלא לקבלת פרוטוקול על אופן התיוג של SUMO וגונדו נמטודה קבוע. בעוד תיוג תאים יונקים הוא די פשוט, תיוג oocytes nematode דורש הכשרה מוקדמת ניתוחי גונד. KmUTAG-FL עם תאי PMT2 קבועים הראו כתמים גרעיניים ברורים.
הן כתמים גרעיניים מפוזרים והן מוקדים גרעיניים ברורים נראו לעין. לוקליזציה גרעינית אושרה באמצעות כתם שותף עם DAPI. בהתאם לפעילות לכידת SUMO של KmUTAG-FL, דפוס לוקליזציה גרעינית היה מזכיר הכתמת SUMO23.
כתמים שותפים בנוגדן נגד SUMO23 8A2 אישרו את ההתאמה של ה-KmUTAG-FL עם אות SUMO23. פעולה זו מאמתת את היעילות של KmUTAG-FL כדי לזהות SUMO23 בתאי יונקים. גונדות מבודדות מהרמפרודיט למבוגרים המייצרות בוציטים.
נמטודות אלגנס סומנו בנוגדנים נגד סומו. בקנה אחד עם דיווחים קודמים, נוגדן נגד SUMO בתחילה מקומי לפלסמה הגרעינית של אוציטים פרופאזה מיוטי מאוחר. לאחר מכן הוא הופץ מחדש למתחם הטבעת המרכזי של ההומולוגים הזוגיים כאשר המעטפה הגרעינית התקלקלה והכרומוזומים נעו לכיוון צלחת המטה-פאזה.
בהכנות מקבילות, גונאדים שכותרתו עם KmUTAG-FL חשפו דפוסים דומים. KmUTAG-FL עבר מתווית הגרעין להתרכז במתחם הטבעת כאשר oocytes החל והשלים את תהליך פירוק המעטפה הגרעינית. תוצאות אלה מאמתות KmUTAG-FL ככלי שימושי לניתוח של מיוזיס ותהליכים הקשורים SUMO ב- c.
אלגנס ואולי נמטודות אחרות. בעת ביצוע קיבעון, זה קריטי להשתמש paraformaldehyde טרי זמן קיבוע קצר כדי לשמור על SUMO מקופל באופן מקורי, כך שהוא יכול להיות מוכר על ידי KmUTAG. מכיוון שהמבנה שליו של SUMO שמור מאוד, סביר מאוד כי גרסאות SUMO ממודלים נוספים ומערכות שאינן מודל ניתן לנתח עם ריאגנט KmUTAG-FL.
נכון לעכשיו, אנו משתמשים בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני זה כדי לחקור את הפונקציה של SUMO במהלך הלחץ התאי. לבסוף, שים לב כי כל השלבים באמצעות paraformaldehyde תיקון צריך להתבצע מכסה המנוע בטיחות במעבדה ואת זה reagent יש להיפטר כראוי.
