Это видео показывает, как подготовить два различных типа субстратов клеточной культуры с помощью коллагена типа I и двухмерного и трехмерного метода культуры. Трехмерный метод культуры рассматривается в биологической среде, демонстрируя, как легко подготовить трехмерный субстрат культуры полезен для исследований. Во многих типах клеток, несмотря на использование одного и того же коллагена, поведение клеток значительно варьируется между двумерными и трехмерными субстратами.
Используя трехмерный субстрат культуры, поведение клеток, которое больше похоже на поведение живых организмов, может быть легко исследовано. Этот метод очень прост и требует минимального специального реагента. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, потому что, хотя мы хотим продемонстрировать, что этот метод легко пытается, трехмерный гель является хрупким, и обработка его должным образом очень важно.
Для начала подготовьте соответствующую культурную среду. Чтобы начать подготовку коллагена, поместите 10x PBS, деионизированную воду, коллаген, 96-колодец культуры пластины, и пустой двухми миллилитровой трубки на льду. Используя пипетку, добавьте 1,12 миллилитров деионизированной воды в пустую двухми миллилитровую трубку.
Добавьте 200 микролитров 10x PBS в деионизированную воду и аккуратно встряхните трубку несколько раз. Непосредственно перед использованием добавьте 0,66 миллилитров коллагена в двухми миллилитровую трубку. Аккуратно и быстро встряхните трубку несколько раз.
Налейте 100 микролитров этого коллагенового раствора в каждую скважину из 96-колодец культуры пластины, убедившись, чтобы покрыть всю поверхность скважин. Аккуратно встряхните пластину, используя движение слева направо. Инкубировать культурную пластину в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
Затем наклоните пластину, чтобы подтвердить гелеобразование коллагена, и переместить культурную пластину на чистую скамейку. Аккуратно налейте 150 микролитров K110 на гели, пролитые трубами вдоль стенки колодеца. Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
После этого переместите культурную тарелку на чистую скамейку. Непосредственно перед клеточной культурой используйте пипетки, чтобы аккуратно сбросить K110. Сначала используйте пипетку, чтобы добавить четыре микролитров коллагена в 1,2 миллилитров одной миллимолярной соляной кислоты в 1,5-миллилитровую трубку и аккуратно перемешать.
Налейте 100 микролитров этой коллагеновой смеси в каждый колодец новой пластины культуры 96-колодец. Аккуратно встряхните тарелку в движении слева направо и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. После этого отбросьте раствор коллагена.
Используя пипетку, мыть каждый хорошо с PBS. Добавьте 150 микролитров 1%BSA и PBS к каждому колодец культурной пластины, и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. Перед культурой клеток отбросьте решение 1%BSA.
Для начала подготовьте клетки FEPE1L-8 и ингибитор K110, трипсин и трипсин, как указано в текстовом протоколе. Тщательно удалите среду из культуры блюдо, и использовать пипетки, чтобы добавить три миллилитров 0,05%трипсина. Поместите блюдо обратно в инкубатор двуокиси углерода, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
Затем используйте фазовую контрастную микроскопию при увеличении в 10 раз, чтобы проверить отслоение клеток от поверхности культуры блюда. Добавьте три миллилитров ингибитора трипсина и используйте пипетку для сбора отдельных клеток в 15-миллилитровой центрифуге. Центрифуга по 200 раз г в течение пяти минут.
После этого, отбросить супернатант, и повторно гранулы в 10 миллилитров K110. Используйте фазовую контрастную микроскопию при увеличении в 10 раз, чтобы подсчитать клетки и разбавить клетки K110 плотностью клеток 50 000 клеток на миллилитр. Аккуратно семя 0,1 миллилитров клеточной подвески в каждый колодец культуры пластины путем трубопроводов вдоль стены хорошо.
Инкубация в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение соответствующего периода времени. Первая смесь 130 микролитров тетразолиевой соли и WST-8 с 1,3 миллилитров разогретого K110 в двухми миллилитровой трубке. Переместите культурную пластину на чистую скамейку и используйте пипетки, чтобы аккуратно выбросить K110 из колодцев.
Аккуратно смойте и неадхерентные клетки С K110. Затем добавьте 110 микролитров K110, смешанных с WST-8 к каждому хорошо. Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.
После этого переместите культурную тарелку на чистую скамейку. Соберите 100 микролитров кондиционированной среды из каждой скважины, и переместить его в колодцы новой пластины культуры 96 скважин. Используя считыватель микроплатформ, измерьте абсорбанс на 450 нанометров и оцените количество жизнеспособных ячеек.
Морфология клеток наблюдается на не-фиброзных и фибрилляции формы показаны здесь. В первые два часа культивирования клетки придерживаются и распространяются на обе формы коллагена. Через три дня после посева, клетки на не-фиброзной форме продолжают распространяться, и количество клеток увеличивается, в то время как клетки на форме фибриллы показывают ограниченное распространение.
Клетки FEPE1L-8 продолжают размножаться на нефиброзной форме коллагена типа I и на необработанных поверхностях посуды. В отличие от этого, клетки не размножаются на фибрилляции форме. При попытке этой процедуры, важно помнить, что трехмерный гель очень хрупкий.
Нужно быть осторожным, чтобы убедиться, что решение или советы не вступают в прямой контакт с гелями. Этот метод может быть изменен по-разному. Например, для смешивания мембранных компонентов образца можно сделать субстрат клеточной культуры, имитирующие мембрану подвала.
Во многих случаях функции внеклеточной матрицы в живых телах неизвестны. Для культуры клеток на трехмерной культуры, можно изучить функцию внеклеточного компонента матрицы, которая больше похожа на живое тело. Применяя трехмерные методы культуры геля, можно эффективно проверить концентрацию наркотиков в клетках.
Этот протокол, основанный на своей цели, может быть использован для разработки сложных трехмерных субстратов культуры путем смешивания других компонентов EGM или факторов роста во время гелеобразований.
