Dieses Video zeigt, wie zwei verschiedene Arten von Zellkultursubstraten mithilfe von Kollagen typ I und einer zweidimensionalen und dreidimensionalen Kulturmethode vorbereitet werden. Die dreidimensionale Kulturmethode wird als biologische Umgebung betrachtet, was zeigt, wie man leicht ein dreidimensionales Kultursubstrat vorbereitet, ist für Studien nützlich. In zahlreichen Zelltypen variiert das Zellverhalten trotz der Verwendung des gleichen Kollagens erheblich zwischen zwei- und dreidimensionalen Substraten.
Mit Hilfe des dreidimensionalen Kultursubstrats könnte das Zellverhalten, das dem von lebenden Organismen ähnlicher ist, leicht untersucht werden. Diese Methode ist sehr einfach und erfordert minimale spezielle Reagenz. Visuelle Demonstration ist wichtig, denn während wir zeigen wollen, dass diese Methode leicht versucht werden kann, ist das dreidimensionale Gel zerbrechlich, und die richtige Handhabung ist sehr wichtig.
Zu Beginn bereiten Sie das entsprechende Kulturmedium vor. Um mit der Vorbereitung des Kollagens zu beginnen, legen Sie 10x PBS, entionisiertes Wasser, Kollagen, eine 96-Well-Kulturplatte und eine leere Zwei-Milliliter-Röhre auf Eis. Mit einer Pipette 1,12 Milliliter entionisiertes Wasser in das leere Zwei-Milliliter-Rohr geben.
Fügen Sie dem entionisierten Wasser 200 Mikroliter 10x PBS hinzu und schütteln Sie das Rohr mehrmals vorsichtig. Unmittelbar vor der Anwendung 0,66 Milliliter Kollagen in die Zwei-Milliliter-Röhre geben. Schütteln Sie die Röhre vorsichtig und schnell mehrmals.
Gießen Sie 100 Mikroliter dieser Kollagenlösung in jeden Brunnen der 96-Well-Kulturplatte und decken Sie die gesamte Oberfläche der Brunnen ab. Schütteln Sie die Platte vorsichtig mit einer Bewegung von links nach rechts. Inkubieren Sie die Kulturplatte in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Dann kippen Sie die Platte, um die Gelation des Kollagens zu bestätigen, und bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank. Gießen Sie 150 Mikroliter K110 vorsichtig auf die Gele, indem Sie entlang der Wand des Brunnens pfeifen. In einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren.
Danach bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank. Unmittelbar vor der Zellkultur verwenden Sie eine Pipette, um den K110 vorsichtig zu entsorgen. Verwenden Sie zunächst eine Pipette, um vier Mikroliter Kollagen zu 1,2 Milliliter einer Millimolaren Salzsäure in einem 1,5-Milliliter-Rohr hinzuzufügen, und mischen Sie es vorsichtig.
Gießen Sie 100 Mikroliter dieser Kollagenmischung in jeden Brunnen einer neuen 96-Well-Kulturplatte. Schütteln Sie die Platte vorsichtig in einer Bewegung von links nach rechts und bebrüten Sie bei Raumtemperatur eine Stunde lang. Danach entsorgen Sie die Kollagenlösung.
Mit einer Pipette, waschen Sie jeden gut mit PBS. Fügen Sie 150 Mikroliter 1%BSA und PBS zu jedem Brunnen der Kulturplatte hinzu und brüten Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde. Verwerfen Sie vor der Zellkultur die 1%BSA-Lösung.
Bereiten Sie zunächst die FEPE1L-8-Zellen und die K110-, Trypsin- und Trypsin-Inhibitoren wie im Textprotokoll beschrieben vor. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der Kulturschale, und verwenden Sie eine Pipette, um drei Milliliter 0,05%Trypsin hinzuzufügen. Legen Sie die Schale wieder in den Kohlendioxid-Inkubator und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.
Verwenden Sie dann die Phasenkontrastmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung, um die Zellablösung von der Oberfläche der Kulturschale zu überprüfen. Fügen Sie drei Milliliter Trypsin-Inhibitor hinzu, und verwenden Sie eine Pipette, um die abgetrennten Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr zu sammeln. Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten.
Danach den Überstand entsorgen und das Pellet in 10 Milliliter K110 wieder aufhängen. Verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung, um die Zellen zu zählen, und verdünnen Sie die Zellen mit K110 auf eine Zelldichte von 50 000 Zellen pro Milliliter. Saugen 0,1 Milliliter der Zellsuspension in jeden Brunnen der Kulturplatte, indem sie entlang der Wand des Brunnens pfeifen.
In kubieren Inkubation in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Dauer. Mischen Sie zunächst 130 Mikroliter Tetrazoliumsalz und WST-8 mit 1,3 Millilitervorgeheiztem K110 in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank und verwenden Sie eine Pipette, um die K110 vorsichtig aus den Brunnen zu entsorgen.
Mit K110 sanft wegwaschen und nicht haftende Zellen. Dann fügen Sie 110 Mikroliter K110 gemischt mit WST-8 zu jedem Brunnen. In einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden inkubieren.
Danach bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank. Sammeln Sie 100 Mikroliter des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen und bewegen Sie es in die Brunnen einer neuen 96-Well-Kulturplatte. Messen Sie mit einem Mikroplattenleser die Absorption von 450 Nanometern und schätzen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen.
Die Zellmorphologie wird auf den nichtfaserigen und fibrillen Formen beobachtet. In den ersten zwei Stunden der Kultivierung haften und verbreiten sich die Zellen auf beiden Formen von Kollagen. Drei Tage nach der Aussaat breiten sich die Zellen auf der nichtfaserigen Form weiter aus, und die Zellzahlen nehmen zu, während die Zellen auf der fibrilen Form eine begrenzte Ausbreitung aufweisen.
FEPE1L-8-Zellen vermehren sich weiterhin auf der nichtfaserigen Form von Kollagen Typ I und auf den unbehandelten Schalenoberflächen. Im Gegensatz dazu vermehren sich die Zellen nicht auf der fibrilen Form. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das dreidimensionale Gel sehr zerbrechlich ist.
Man muss aufpassen, dass die Lösung oder die Spitzen nicht direkt mit den Gelen in Berührung kommen. Diese Methode kann auf vielfältige Weise geändert werden. Um beispielsweise die Membrankomponenten der Probe zu mischen, kann man ein Zellkultursubstrat herstellen, das eine Kellermembran imitiert.
In zahlreichen Fällen sind die Funktionen der extrazellulären Matrix in lebenden Körpern unbekannt. Um Zellen in der dreidimensionalen Kultur zu kulturieren, kann man die Funktion der extrazellulären Matrixkomponente untersuchen, die dem lebenden Körper ähnlicher ist. Durch die Anwendung dreidimensionaler Gelkulturtechniken kann man effektiv die Konzentration von Medikamenten in Zellen testen.
Dieses Aufderatrat könnte verwendet werden, um komplexe dreidimensionale Kultursubstrate zu entwickeln, indem andere EGM-Komponenten oder Wachstumsfaktoren während der Gelationen gemischt werden.
