Этот метод облегчает эффективную внутритекалию доставки адено-ассоциированных вирусных трансгенов у бодрствующих мелких животных для экспериментального лечения заболеваний центральной нервной системы, таких как ALS. Основным преимуществом этого метода является то, что вирусный раствор включает в себя 1%лидокаин гидрохлорид, который вызывает переходный паралич после успешной инъекции. Хотя этот метод обеспечивает визуальный показатель для оценки успеха внутритекалио автоматизированной ситуации, достаточная практика имеет важное значение для повышения успешности доставки.
Перед началом процедуры прикрепите 27-го калибра иглы к 25 микролитровому шприцу Гамильтона и выровняете скошенный кончик иглы с объемной шкалой на шприце. Затем осторожно загрузите 8 микролитров от 4 х 10 до 10-го генома копии раствора вируса в шприц, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Затем поместите бодрствующее 30-70-дневное 12-30-граммовую мышь на кусок кровати в положении, подверженном биобезопасности, и накройте верхнюю часть тела стерильной марлей, чтобы успокоить мышь и избежать укуса.
Твердо сцепление мыши на тазовом поясе с большим пальцем на одной стороне и указательный палец и средний палец на другой стороне поддержанию кожи между двусторонними тазовых поясов тугой с большим и указательным пальцами. Затем побрить мех между двусторонними тазовыми поясами и стерилизовать открытые кожи с йодом основе скраб и 70%этанола. Для прямой внутритехальной доставки адено-ассоциированного вирусного раствора, пальпировать межпозвонковое пространство вдоль средней линии между двусторонними тазовыми поясами и использовать ногти, чтобы угнетать отступ в кожу, чтобы указать L5 до L6 межпозвонкового пространства.
Поверните основание хвоста слегка и осторожно, чтобы выявить середину позвоночника и настроить скошенную иглу к голове животного. С помощью мыши, прочно закрепленной в положении, выровняйте иглу вдоль средней линии позвоночника и вставьте иглу мягко и вертикально в центр отступа, удерживая шприц в центральной сагиттаальной плоскости. Когда игла вступает в контакт с костью, медленно уменьшаем угол примерно до 30 градусов и скольжение иглы в межпозвонковое пространство.
Внезапное движение хвоста является признаком успешного входа во внутридуральное пространство. Когда игла входит в межпозвонковое пространство, кончик будет чувствовать себя твердо зажатым. Введи векторный раствор и поддерживайте иглу внутри внутридурального пространства в течение одной минуты.
Затем медленно снять иглу с вращением, чтобы свести к минимуму утечку. Немедленно забить преходящую слабость конечностей мыши, чтобы оценить качество инъекции и вернуть мышь в клетку для восстановления после паралича. В соответствующей экспериментальной конечной точке, исправить конечностей и головы вводили мыши в положении склонны на крышку пены коробки и использовать ножницы, чтобы раздеться и удалить кожу с головы до крестца.
Зарежьте череп между глазами, прорежьте вдоль средней линии черепа и горизонтальной линии над мозжечок и откройте череп с каждой стороны. Используйте пинцет для удаления затылочной кости и использовать офтальмологические ножницы, чтобы открыть позвоночный канал на двусторонней основе. Вырезать ребра с обеих сторон и тщательно удалить верхнюю часть позвонков.
Используйте изогнутые пинцеты, чтобы поднять мозг и разорвать нервы основания черепа. Затем тщательно извлечь весь мозг и спинной мозг и исправить ткани в 4%paraformaldehyde в течение 24 часов. В конце периода фиксации криопротезирование головного и шейного и поясничного спинного мозга в 30%-ном растворе сахарозы на ночь при температуре 4 градуса Цельсия с последующим встраиванием в оптимальное температурное соединение резки перед оснасткой замораживания в жидком азоте.
Затем используйте криостат для получения 25 микрометров толщиной разделов каждой ткани, хранение замороженных секций в 0,01 молара PBS при 4 градусах по Цельсию, как они получены. Для иммуногистохимического анализа тканей предварительно обработать свободно плавающие секции с 1%перекисью водорода в течение 10 минут с последующим 10-минутным мытьем в PBS. Далее инкубировать образцы в блокирующий раствор, содержащий 5%сыворотки и 0,3%неионные моющие средства в PBS в течение 1 часа, а затем ночь маркировки при 4 градусах по Цельсию с соответствующими первичными антителами интереса.
На следующий день, мыть разделы с 3 10 минут моет в PBS плюс Tween и инкубировать слайды с соответствующими соответствующими биотинилированных вторичных антител при комнатной температуре в течение 1 часа после последней стирки. В конце инкубации, мыть разделы 3 раза в свежем PBST, как только что продемонстрировали и инкубировать образцы с бесконечности биотин пероксидазы комплекса в течение 40 минут с последующим окрашиванием с соответствующим хромогенным агентом. Намонтировать помеченные разделы на стеклянный микроскоп слайды и замочить слайды в ангидроус этанола в течение 5 минут, как только установленные разделы полностью высохли.
Затем замочите горки в ксилене в течение 10 минут и запечатайте их соответствующей крепления среды. Затем изображение слайдов с легким микроскопом оснащен зарядом в сочетании устройства на 100, 200 и 400 раз увеличения. eGFP иммуностимпляции шейки матки и поясничного отдела ткани спинного мозга показывает мало или в отсутствие трансдукции в поясничном спинном мозге мышей со слабостью оценка 0, слегка расширенной трансдукции у мышей со слабостью оценка 1, и сильные и широко распространенные трансдукции у мышей со слабостью оценка 4 или 5.
Количественная оценка интенсивности окрашивания GFP секций тканей спинного мозга у мышей, отображающих различные степени преходящей слабости конечностей, указывает на то, что тяжесть слабости после инъекции раствора вируса тесно коррелирует с степенью трансдукции спинного мозга. В головном мозге, надежные сигналы eGFP обнаруживаются в обонятельной лампы, дорсолатеральной префронтальной коры, зубчатой извилины, и CA3 зоны гиппокампа, мозжечковой коры, и маргинальных областях ствола мозга, в том числе лицевого ядра, хороидного сплетения, и эпендимальных эпителиальных клеток. Моторные нейроны в передних рогах также сильно трансуцируются в различных уровнях спинного мозга.
Кроме того, в коре головного мозга обнаруживаются положительные нейроны GFP, включая пирамидальные клетки, а также различные типы глиальных клеток, включая микроглию, астроциты и олигодендроциты. Этот метод позволяет исследователям в области неврологии исследовать терапевтическое воздействие прямых внутритекаальных родов у мелких бодрствующими животными при заболеваниях центральной нервной системы.
