هذه الطريقة تسهل التسليم الفعال داخل منطقة المحيط الفوقا للعدوى الفيروسية المرتبطة adeno في الحيوانات الصغيرة مستيقظا للعلاج التجريبية لأمراض الجهاز العصبي المركزي مثل ALS. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الحل الفيروسي يشمل 1٪ ليدوكاين هيدروكلوريد الذي يسبب شلل عابر بعد الحقن الناجح. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر مؤشرا بصريا للحكم على نجاح الوضع الآلي داخلا، والممارسة الكافية أمر ضروري لتحسين معدل نجاح التسليم.
قبل البدء في الإجراء، قم بتوصيل إبرة قياس 27 بحقنة هاملتون 25 ميكروليتر ومحاذاة طرف الإبرة المشططوف مع المقياس الحجمي على الحقنة. ثم تحميل بعناية 8 ميكرولترات من 4 × 10 إلى 10 نسخ الجينوم من حل الفيروس في الحقنة، مع الحرص على تجنب فقاعات. بعد ذلك، ضع ماوسًا مستيقظًا من 30 إلى 70 يومًا من العمر 12 إلى 30 جرامًا على قطعة سرير في موضعه المعرض في غطاء للسلامة الحيوية وغط الجزء العلوي من الجسم بشاش معقمة لتهدئة الماوس وتجنب التعرض للعض.
قبضة بحزم الماوس على حزام الحوض مع الإبهام على جانب واحد والسبابة والاصبع الأوسط على الجانب الآخر حفظ الجلد بين حزام الحوض الثنائي مشدود مع الإبهام والسبابة. ثم حلق الفراء بين احزمة الحوض الثنائية وتعقيم الجلد المكشوف مع فرك اليود القائم والإيثانول 70٪. للتسليم المباشر داخل المنطقة من حل الفيروس المرتبط بأدينو، جس الفضاء بين الفقرات على طول خط الوسط بين مربط الحوض الثنائي واستخدم ظفرًا لتخريب المسافة البادئة في الجلد للإشارة إلى المساحة الفقرية L5 إلى L6.
تدوير قاعدة الذيل قليلا وبلطف للكشف عن خط الوسط من العمود الفقري وضبط شطبة من الإبرة نحو رأس الحيوان. مع الماوس ثابتة بحزم في الموقف، محاذاة الإبرة على طول خط الوسط من العمود الفقري وإدراج إبرة بلطف وعموديا في وسط المسافة البادئة حفظ حقنة في مستوى القوس المركزي. عندما يأتي الإبرة في اتصال مع العظام، وانخفاض ببطء زاوية إلى ما يقرب من 30 درجة وزلة الإبرة في الفضاء بين الفقرات.
نفض الغبار ذيل المفاجئ هو علامة على دخول ناجحة في الفضاء داخل الأمعاء. عندما تدخل الإبرة إلى الفضاء الفقري، سوف تشعر التلميح بتضييق الخناق عليها. حقن حل ناقلات، والحفاظ على إبرة داخل الفضاء داخل الأمعاء لمدة دقيقة واحدة.
ثم سحب ببطء الإبرة مع دوران للحد من التسرب. على الفور تسجيل الضعف العابر لأطراف الماوس لتقييم جودة الحقن والعودة إلى قفص الماوس للتعافي من الشلل. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بإصلاح أطراف الماوس المحقون ورأسه في موضع العرّضة على غطاء صندوق الرغوة واستخدم المقص لتجريد الجلد من الرأس إلى العجز.
قص الجمجمة بين العينين، وقطع على طول خط الوسط من الجمجمة والخط الأفقي فوق المخيخ وفتح الجمجمة على كل جانب. استخدم ملاقط لإزالة العظم القذالي واستخدام مقص العيون لفتح القناة الشوكية ثنائياً. قطع الأضلاع على كلا الجانبين وإزالة بعناية الجزء العلوي من الفقرات.
استخدم ملاقط منحنية لرفع الدماغ وقطع أعصاب قاعدة الجمجمة. ثم استخراج بعناية الدماغ كله والحبل الشوكي وإصلاح الأنسجة في 4٪ شبهformaldehyde لمدة 24 ساعة. في نهاية فترة التثبيت، cryoprotect الدماغ وعنق العنق والحبل الشوكي القطني في محلول السكروز 30٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها تضمين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل قبل المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل.
ثم استخدم المبردات للحصول على 25 ميكرومتر سميكة أجزاء من كل نسيج، وتخزين المقاطع المجمدة في 0.01 PBS الضرس في 4 درجات مئوية كما يتم الحصول عليها. للتحليل المناعي الكيميائي للأنسجة، قبل معالجة الأجزاء العائمة الحرة مع بيروكسيد الهيدروجين 1٪لمدة 10 دقائق تليها غسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان المقبل العينات في محلول منع تحتوي على 5٪ مصل و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة تليها وضع العلامات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة.
في اليوم التالي، وغسل المقاطع مع 3 10 غسل دقيقة في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى توين واحتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة الحيوية المناسبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة بعد الغسيل الماضي. في نهاية الحضانة، وغسل أقسام 3 مرات في PBST جديدة كما أظهرت للتو واحتضان العينات مع مجمع peroxidase البيوتين اللانهاية لمدة 40 دقيقة تليها تلطيخ مع عامل chromogenic المناسبة. قم بتركيب المقاطع المسماة على شرائح المجهر الزجاجي ونقع الشرائح في الإيثانول اللامائية لمدة 5 دقائق بمجرد أن تجفف الأجزاء المثبتة بالكامل.
المقبل نقع الشرائح في إكسيلين لمدة 10 دقائق وختم لهم مع وسيلة مناسبة تصاعد. ثم صورة الشرائح مع مجهر خفيف مجهزة جهاز الشحن مقرونة في 100، 200، و 400 مرة التكبير. eGFP المناعة من عنق الرحم والأقسام النسيج النخاعي القطني يكشف عن القليل أو لا تحويل في الحبل الشوكي القطني من الفئران مع درجة ضعف 0، وتعزيز قليلا تحويل في الفئران مع درجة ضعف 1، وtransductions قوية وواسعة النطاق في الفئران مع درجة ضعف 4 أو 5.
يشير القياس الكمي لشدة تلطيخ GFP لأطراف أنسجة الحبل الشوكي من الفئران التي تعرض درجات مختلفة من ضعف الأطراف العابرة إلى أن شدة الضعف بعد حقن محلول الفيروس ترتبط ارتباطًا وثيقًا بمدى نقل الحبل الشوكي. في الدماغ، يتم الكشف عن إشارات eGFP قوية في لمبة الشم، القشرة الجبهي الظهرية، الجيروسكوبية، وcyrus، ومنطقة CA3 من قرن آمون، قشرة المخ، والمناطق الهامشية من الدماغ، بما في ذلك نواة الوجه، الضفيرة المشيمية، والخلايا الظهارية. الخلايا العصبية الحركية في قرون الأمامية هي أيضا نقل بقوة في مستويات مختلفة من الحبل الشوكي.
وعلاوة على ذلك، في القشرة، يتم الكشف عن الخلايا العصبية الإيجابية GFP بما في ذلك الخلايا الهرمية، فضلا عن أنواع الخلايا الدبقية المختلفة بما في ذلك microglia، استروتكس، و oligodendrocytes. هذه التقنية تمكن الباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الآثار العلاجية للتسليم المباشر داخل داخل الحيوانات الصغيرة مستيقظا على أمراض الجهاز العصبي المركزي.
