P19 клеточной линии, как известно, дифференцироваться в нейроны. Тем не менее, протокол для дифференциации нейронов линии клеток P19 иногда сложны. Этот метод позволяет нам выполнять нейрогенный эксперимент в удобной для пользователя манере и расширить возможность использования линии клеток P19 в будущем.
Для начала, поддерживать P19 клеток в поддержании среды, состоящей из DMEM, с 4,5 граммов на литр глюкозы, дополняется 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 единиц на миллилитр пенициллина, и 100 единиц на миллилитр стрептомицина. Инкубировать клеточной культуры в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа окружающей среды, пока клетки примерно 80%confluent. Удалите отлаченную среду из колбы клеточной культуры и промыть клетки двумя миллилитров кальция и магния свободной PBS.
Добавьте один миллилитр 0,25%трипсина-ЭДТА, чтобы полностью покрыть монослой клеток и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение двух-трех минут. Под микроскопом, проверьте, если все клетки отделены. Resuspend клетки в 9 миллилитров средства обслуживания для того чтобы нейтрализовать трипсин.
Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 200 Г и комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Затем, аспирировать супернатант, не нарушая гранулы. Повторное использование гранул в 10 миллилитров свежей среды технического обслуживания и использовать счетчик ячейки, чтобы определить номер ячейки в соответствии с инструкциями производителя.
Семя 20 000 ячеек на квадратный сантиметр в новой колбе Т-25 и добавить до 10 миллилитров среды обслуживания. Инкубация при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение двух-трех дней. Чтобы начать пищеварение трипсина, сначала медленно аспирировать супернатант и мыть клетки с двумя миллилитров кальция и магния свободной PBS.
Затем добавьте один миллилитр 0,25%трипсина EDTA в клетки и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение двух-трех минут. После инкубации, чтобы нейтрализовать трипсин, повторно почерпните клетки в девяти миллилитров дифференциации среды, состоящий из DMEM с высоким уровнем глюкозы и дополнен 5%fetal бычьей сыворотки, 100 единиц на миллилитр пенициллина, и 100 единиц на миллилитр стрептомицин. Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 200 Г и комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки.
Затем, медленно аспирировать супернатант и повторно гранулы в один миллилитр свежей дифференциации среды без РА. Используйте счетчик ячеек для определения номера ячейки в соответствии с инструкциями производителя. Для агрегатного поколения начните с добавления 10 миллилитров дифференциации среды, дополненной пятью микролитров РА, к 100-миллилитровому, необработанному культуре блюда. Семя один миллион клеток в культуре блюдо и инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение двух дней, с тем чтобы способствовать совокупному образованию.
После инкубации, с 10-миллилитровой пипеткой, аспирировать среды, содержащие агрегаты и передать его в 15-миллилитровую трубку при комнатной температуре. Подождите 1,5 минуты, пока агрегаты оседают внизу, а затем отбросьте супернатант. Добавьте 10 миллилитров свежей дифференциации среды, дополненной 0,5 микромолярной РА. Аккуратно посеять агрегаты в новом 100-миллиметровом, необработанном культуре блюда и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение двух дней.
Для начала используйте 10-миллилитровую пипетку для переноса агрегатов клеток в 15-миллилитровую трубку. Подождите 1,5 минуты при комнатной температуре для агрегатов, чтобы поселиться в нижней части, а затем отказаться от супернатанта. Вымойте агрегаты сывороткой и без антибиотиков DMEM.
Подождите, пока клеточные агрегаты оседают внизу, отбросьте супернатант и добавьте два миллилитров 0,25%трипсина EDTA. Инкубировать трубку в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, нажав каждые две минуты, чтобы держать клетки в подвеске. Затем добавьте четыре миллилитров среды технического обслуживания, чтобы остановить активность трипсина и пипетки вверх и вниз 20 раз с помощью одноми миллилитровой пипетки.
Наконец, центрифуга клеток в 200 раз G и комнатной температуры в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно наполнить клеточные гранулы в пяти миллилитров среды обслуживания. Используйте счетчик ячеек, чтобы определить номер ячейки и приступить к облицовке ячеек.
Чтобы пластины клеток, сначала добавить три миллилитров на колодец обслуживания среды до шести хорошо культуры пластины. Затем посеять клетки при плотности 500 000 на колодец. Инкубировать пластину при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе.
Семя клетки на крышку очки в шесть хорошо культуры пластины. Когда они достигнут 20%слияния, приступить к иммуностимулятора с анти-MAP2 антитела. Затем изолируйте РНК и выполните обратную транскрипцию ПЦР для MAP2, NueN, OCT4, NANOG и GAPDH.
В этом исследовании вводится упрощенный метод дифференциации нейронов. Линия клеток P19 культурируется в необработавом блюде культуры с 5%FBS и 0,5 микромолярем РА. Через четыре дня клеточные агрегаты разобщены трипсином и посеяны на пластине культуры клеток в течение следующих четырех дней. Эффективность этого метода оценивается путем сравнения анализа RTPCR клеточной линии P19 в недифференцированном состоянии и во время нейрогенеза.
Результаты показывают быстрое снижение экспрессии генов плюрипотенции, таких как Oct4 и NANOG, и upregulation генов нейрномальных маркеров, таких как MAP2 и NeuN. Мы считаем, что метод, разработанный в этом исследовании прост и будет играть определенную роль в выяснении молекулярных механизмов нейрогенеза, а также нейродегенеративных заболеваний.
