使用P19胚胎癌细胞的神经发生

P19细胞系已知分化成神经元。然而，P19细胞系神经元分化的协议有时很复杂。这种方法使我们能够以用户友好的方式进行神经基因实验，并扩大未来使用P19细胞系的可能性。

首先，保持P19细胞在维持介质，包括DMEM，与4.5克每升葡萄糖，辅以10%胎儿牛血清，100单位每毫升青霉素，和100单位每毫升链霉素。在37摄氏度和5%的二氧化碳环境中孵育细胞培养，直到细胞约80%汇合。从细胞培养瓶中去除所花的培养基，用两毫升钙和无镁的PBS清洗细胞。

加入一毫升0.25%的三辛-EDTA，完全覆盖细胞的单层，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育2至3分钟。在显微镜下，检查是否所有细胞都分离。将细胞重新用9毫升的维持介质中重新暂停，以中和尝试素。

将细胞转移到15毫升管中，在200倍G和室温下离心5分钟，对细胞进行颗粒。然后，吸上一道，而不干扰颗粒。将颗粒重新用 10 毫升的新鲜维护介质中重新供应，并使用细胞计数器根据制造商的说明确定细胞号。

在一个新的T-25烧瓶中每平方厘米播种2万个细胞，并加起来有10毫升的维持介质。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育两到三天。要开始尝试性消化，首先慢慢吸上先机，用两毫升钙和无镁PBS清洗细胞。

然后，在细胞中加入一毫升0.25%的三丁辛EDTA，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育，两到三分钟。孵育后，为了中和胰蛋白石，在9毫升的分化介质中重新释放细胞，由高血糖水平的DMEM组成，并辅以5%的胎儿牛血清、每毫升青霉素100个单位和每毫升链霉素100个单位。将细胞转移到15毫升管中，在200倍G和室温下离心5分钟，对细胞进行颗粒。

然后，慢慢吸气上一个液，并在一毫升新鲜分化介质中重新暂停颗粒，无需RA。使用单元格计数器根据制造商的说明确定单元格编号。对于聚合生成，首先添加 10 毫升的分化介质，并辅以 5 微升的 RA 到 100 毫升、未处理的培养皿中。在培养皿中播种100万个细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育两天，以促进聚集的形成。

孵育后，用10毫升移液器，吸出含有集料的介质，并在室温下将其转移到15毫升管中。等待 1.5 分钟，让聚合在底部稳定，然后丢弃上清液。加入10毫升新鲜分化介质，辅以0.5微摩尔RA。在100毫米的未处理培养皿中轻轻播种，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育两天。

首先，使用10毫升移液器将细胞聚集转移到15毫升管中。在室温下等待 1.5 分钟，让集料在底部沉淀，然后丢弃上清液。用血清和不含抗生素的DMEM清洗集料。

等待细胞聚合在底部稳定，丢弃上清液，并添加两毫升 0.25% trypsin EDTA。在37摄氏度的水浴中孵育管子10分钟，每两分钟敲击一次，使细胞保持悬浮状态。然后，添加四毫升的维护介质，以阻止尝试性活性，使用一毫升移液器上下移液器 20 次。

最后，在200倍G和室温下将细胞离心5分钟。取出上一提液，将细胞颗粒重新在五毫升的维护介质中。使用单元格计数器确定单元格编号，然后继续电镀单元格。

板细胞，首先向六井培养板中每井添加三毫升的维护介质。然后，以每井50万的密度播种细胞。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。

将盖上眼镜上的细胞播种在六井培养板中。当它们达到20%汇合时，使用抗 MAP2 抗体进行免疫抑制。然后，分离RNA，并执行逆转录PCR的 MAP2，NueN，OCT4，NANOG 和 GAPDH。

本研究介绍了一种简化的神经元分化方法。P19细胞系在未处理的培养皿中培养，具有 5%FBS 和 0.5 微摩尔 RA。四天后，细胞聚合与尝试性分离，并在未来四天内在粘附细胞培养板上播种。通过比较P19细胞系在无分化状态和神经生成期间对P19细胞系的RTPCR分析，计算了该方法的效率。

结果表明，10月4日、NANOG等多能基因的表达迅速减少，MAP2和Nein等神经性标记基因的调节作用迅速加快。我们相信，本研究中开发的方法很简单，在阐明神经生成以及神经退行性疾病的分子机制方面将起到一些作用。