Мы описываем здесь в первый раз метод, который позволяет высокой пропускной способности скрининга наркотиков для сенотерапевтических соединений, которые были показаны, чтобы быть полезным в связанных со старением заболеваний. В самом деле, несколько клинических испытаний с препаратами испытания в этой сущности в настоящее время продолжается. Основным преимуществом этого метода является различие между двумя типами сенотерапевтических препаратов, сенолитики и сеноморфики, с помощью хорошо установленного обнаружения SA-бета-галактозидазы в старческими клетками.
Этот метод является важным инструментом скрининга для новых сенотерапевтических соединений. В самом деле, несколько соединений, которые были определены с помощью этого экрана показаны в различных громких публикаций, и в настоящее время в клинических испытаниях. Этот метод является чрезвычайно универсальным и может быть адаптирован к нескольким высокой пропускной способности экранов.
В самом деле, это возможно мультиплекс экранов, и экран для соединений, которые подавляют сенесценции через активацию или ингибирование одного из нескольких путей. Фарш каждого эмбриона в один миллиметр штук и трубы его вверх и вниз несколько раз. Далее добавьте 10 миллилитров среды роста к тканям каждого эмбриона.
Плита их в 10 сантиметров культуры блюдо, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в 3%кислорода и 5%углекислого газа в течение двух-трех дней. И инкубировать остальную часть каждого эмбриона с 0,25%трипсина EDTA смеси в течение 10 минут. Чтобы трипсинизировать клетки, во-первых, тщательно удалить рост среды и мыть клетки с 10 миллилитров 1X PBS в два раза.
Затем добавьте два миллилитров раствора EDTA 025 трипсина в клетки и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение двух-трех минут. Затем проинспектировать клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки отделены от поверхности. Добавьте такое же количество среды роста, чтобы прекратить переваривание трипсина и перенесите клетки в коническую трубку.
Затем центрифуга клетки на 200 раз G в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте свежую среду роста, чтобы повторно приостановить клетки. Затем подсчитайте клетки и посеять их в новых пластинах при прогнозируемых плотности клеток.
Для не старческого субкультивации, во-первых, разделить слияние клеток в соотношении один к четырем. Затем инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 3%кислорода и 5%углекислого газа, чтобы продлить для другого прохода. Далее, чтобы вызвать старение клеток, семена расщепляют слияние клеток из прохода один в соотношении один к четырем и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в 20%кислорода и 5%углекислого газа окружающей среды в течение трех дней.
Для мониторинга клеточной сенесценции, с передовой системой Coulter Cell Counter, измерять постепенное увеличение диаметра клеток и объема клеток во время каждого шага трипсинизации. Для начала бета-Gal скрининга анализа, семян 5000 старихих клеток или 3000 не-старческие клетки на хорошо в 96 пластин хорошо. Затем добавьте 100 микролитров среды роста к каждой колодец и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 20%кислороде и 5%углекислом газе в течение шести часов.
Затем добавьте разбавления препарата в клетки МЭФ и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 20%кислороде и 5%углекислом газе в течение 24-48 часов. После инкубации удалите раствор препарата и промыте клетки 100 микролитров 1X PBS. Чтобы вызвать лизосомальную щелочность, предварительно обработать клетки 90 микролитров раствора бафиломицинА А1, разбавленного в среде культуры свежих клеток при конечной концентрации 100 наномоляров.
Затем инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 20%кислорода и 5%углекислого газа окружающей среды в течение часа. Для флуоресцентного анализа активности SA-beta-Gal сделайте свежий рабочий раствор C12FDG разбавленным в среде роста, при конечной концентрации 100 микромолей. Затем добавьте 10 микролитров рабочего раствора в культурную среду при конечной концентрации 10 микромоляров и инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 20% кислорода и 5%углекислого газа в течение двух часов.
Вымойте клетки 100 микролитров 1X PBS. Затем добавьте два микролитера 100 микрограмм на миллилитр Hoechst 33342 красителя при конечной концентрации в два микрограмма на миллилитр. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 20% кислорода и 5%углекислого газа в течение 20 минут.
После инкубации удалите средства массовой информации, добавьте 100 микролитров свежей среды роста и приступайте к визуализации. В этом исследовании, с высоким содержанием флуоресцентных изображений приобретения и анализа платформы позволило для выявления сенолитических препаратов, таких как 17-DMAG, что снижение общей SA-бета-Гал деятельности в мурин эмбриональных фибробластов клеточных культур, содержащих старческие клетки в проходе пять. Программно-генерируемый количественный анализ смесей старческими и не старческими клетками позволяет четко провести демонстрацию старческого клеточного воздействия, а также устранение фоновой активности бета-галактозидазы бафиломицином A.Убедитесь, что все необходимые элементы управления клетками включены, особенно необработанные старческие клетки и старческие клетки, обработанные с положительным контролем.
Это эссе включает в себя работу с первичными клетками под окислительным стрессом, который может привести к вариации, которые должны контролироваться. Эта процедура является первым шагом в выявлении сенотерапевтических препаратов. Дополнительные жизнеспособности клеток и клеток старческие эссе должны быть выполнены для подтверждения результатов скрининга.
Несколько новых сенолитических препаратов были обнаружены с помощью этого эссе, в том числе первый сенолитический препарат сочетание дасатиниб кверцетин, тепловой шок белка 90 ингибиторы, Bcl-2 семьи ингибиторы, и полифенол фицетин.
