Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сосудистой ткани инженерии, такие как мониторинг динамики инженерного роста сосудов и ремоделирования в долгосрочной культуре. Основным преимуществом использования оптической скогерентной томографии, или OCT, является то, что она является легкодоступной, в режиме реального времени и неразрушающей стратегией визуализации для характеристики структурных особенностей и процесса реконструкции инженерных сосудов. Демонстрация процедуры также будет Шанмин Лю, и Вентао Ма, техников из моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, изготовить ЭША эшафот, как описано в текстовом протоколе Dip PGA леса в один моль на литр гидроксида натрия в течение одной минуты, чтобы настроить ледниковую структуру сетки. Затем, замочить леса в ткани культуры класса воды три раза в течение двух минут каждый. Каждый раз, осторожно погладить сухой эшафот с бумагой.
Затем высушите строительные леса в капюшоне с воздуходувки в течение одного часа. Чтобы собрать биореактор и y-соединение для oct изображений, во-первых, замочить самостоятельно разработанный стеклянный цилиндрический биореактор, PGA леса, силиконовая трубка, био-совместимые трубки, разъемы, перемешать бар, и оборудование для сборки в 95 процентов этанола бак в течение двух часов. Потяните эшафот PGA через боковые руки биореактора, соединенные с одной стороны с разъемом, а также на другую сторону с y-соединением, используемым для доставки провода руководства OCT.
Соберите еще один эшафот PGA в биореактор таким же образом. Приготовь полиэтилен к губам биореактора, затягивая его 4-0 швами. Положите биореактор в бак этанола снова в течение одного часа, прежде чем сушить его на ночь в капюшоне с воздуходувкой на.
Теперь, изолировать человека пупочной артерии гладкие мышечные клетки из пупочной артерии человека стандартными методами explant В причине сохранения клеток в PGA леса, избежать капает клеточной подвески на дне биореактора. Кроме того, покрыть биореактор с силиконовой стоппер крышкой как можно скорее после клетки сидения для предотвращения загрязнения. Расширьте и поддерживайте клетки в гладкой среде роста мышц.
Семя пупочной артерии человека гладкие мышечные клетки в концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр в вышеупомянутой среде культуры на леса PGA. После размещения сэр бар в биореактор, покрыть его силиконовой пробкой крышкой, которая имеет одну трубку питания и три коротких сегментов трубки вставлены для обмена газа. Прикрепите фильтры PTFE 0.22 micron к каждой трубке изменения воздуха и прикрепите одну крышку гепарина к трубке для кормления.
Отрегулируйте бар перемешивания со скоростью перемешивания 13 раундов в минуту. Затем соберите стеклянный биореактор, силиконовую крышку пробки и эшафот PGA в культурную систему. Позвольте клеткам придерживаться в течение 45 минут, опираясь на биореактор каждые 15 минут с подслой слева и справа.
Теперь подключите насос LOO-OH-YEE, фосфат-буферный солевой мешок, и водитель с биосовместимыми трубками для того, чтобы создать систему изобилия. Откройте драйвер, чтобы заполнить трубки с PBS. Поместите общий биореактор во влажный инкубатор с 5 процентами CO2 при 37 градусах Цельсия.
Заполните культурную камеру 450 миллилитров культурной среды. Выращивать семена леса в соответствии со статической культурой в течение одной недели, изменяя культуру среды каждые три-четыре дня, аспирируя половину старой среды через трубку для кормления и пополнения реактора с эквивалентным количеством свежей среды культуры. Чтобы подготовить систему изобилия для изображения OCT, насос жидкости в сумке PBS, чтобы распространить их через биосовместимые трубки и обратно в сумку.
Откройте мощность водителя и регулировать настройки насоса с частотой 60 ударов в минуту и выход систолического давления 120 миллиметров ртути. Отрегулируйте механические параметры в соответствии с потребностями тканевой инженерной сосудистой культуры. Нажмите кнопку запуска, чтобы система изобилия работала.
Обеспечить исправление пульсирующего моделирования сосудов в течение трех недель путем итеративного давления биосовместимых труб после одной недели статической культуры. Используйте источник света для обеспечения аксиального разрешения от десяти до двадцати микрон и глубины изображения от одного до двух миллиметров для определения структуры тканевых кровеносных сосудов, или TEVBs, на основе частотного домена OCT внутрисосудистой системы визуализации. Включите выключатель питания и откройте программное обеспечение захвата изображения Подключите волоконно-оптический катетер изображения к приводу двигателя и оптического контроллера, с функцией автоматического отступления катетера.
Установите параметры скорости получения изображения до десяти кадров в секунду, с автоматической скоростью отката 10 миллиметров в секунду. Теперь прикрепите катетер к y-junction через крышку гепарина с иглой 18-го калибра. Поместите катетер в силиконовую трубку и определите герметичность структуры сетки PGA перед загрузкой эшафота PGA на биореактор.
Теперь поместите катетер опрокинуть область интереса. Отрегулируйте устройство отката и проверьте качество изображения. Приобретайте изображения в один, четыре, семь, десять, 14, 17, 21 и 28 дней в культуре для каждого отдельного TEBV.
Сохраните эти изображения последовательно с помощью наблюдения в режиме реального времени микроструктуры TEBV, включая поверхностную морфологию, внутреннюю структуру и композицию. Повторите измерение три раза, чтобы получить надежное измерение инженерных судов каждый раз. Захват серии изображений на протяжении всего тестирования с помощью программного обеспечения захвата изображения.
Для использования программного обеспечения для анализа изображений для измерения толщины стенок кровеносных сосудов, разработанных тканей, сначала выберите изображение для анализа. Затем щелкните инструмент отслеживания, чтобы автоматически определить внутреннюю сторону ткани инженерии кровеносных сосудов с программным обеспечением и вручную эскиз внешней стороны. На экране появится диаграмма толщины.
Повторите измерение в течение пяти раз, чтобы получить надежное измерение конструкций. Рассмотрите возможность использования двух независимых следователей, обязанных получить информацию. Откройте силиконовую крышку пробки, помещенную над биореактором, когда культура закончена, и отбросьте культурную среду.
Расслабьте полиэтилен из биореакторных губ и вырежьте ножницами силиконовые трубки с внешней стороны полиэтилена. Урожай TEBVs из биореактора, и разрезать их на разделы для сканирования электронной микроскопии экспертизы. Вытяните поддерживающую силиконовую трубку и зафиксировать секции 4-процентным формальдегидом.
Выполните рутинное гистологическое окрашивание трихромом Массона и серьым красным цветом для изучения морфологии коллагена и PGA. Для оценки содержания PGA и компонента коллагена, наблюдать гистологические образцы с sirious красным окрашивания через поляризованный микроскоп. Изображения OCT сравниваются с гистопатологическими находками TEBV после четырех недель культуры.
Изображение OCT показывает компактную микроструктуру и специфические компоненты по сравнению с гистологической оценкой. Видна культурная среда, силиконовая трубка, TEBV и фрагмент PGA. Трихромное окрашивание Массона демонстрирует коллагеновые волокна, распределенные в определенном направлении, наряду с остатками PGA в медиаслое инженерных сосудов.
Сириус красное окрашивание показывает остатки PGA и коллагенового компонента с помощью поляризованного микроскопа. Сканирующие-электронные микрографы инженерных сосудов демонстрируют компактную микроструктуру. Между тем, этот интралюминальный метод визуализации принимает неразрушающий и легкий мониторинг TEBV, включая процесс реконструкции и визуальную морфологию на месте в долгосрочной культуре.
Как показано здесь, ремоделирование происходит раньше, и морфологические изменения проявляются более очевидно в динамической группе через сравнение толщины TEBV. Этот метод прокладывает путь для исследователей в области инженерии сосудистой ткани для изучения особенностей структуры и долгосрочного процесса реконструкции инженерных сосудов. Четкое отображение полимерных остатков с помощью поляризованной микроскопии в сочетании с ОКТ-изображением может быть полезно для оценки деградации лесов.
