Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da engenharia de tecidos vasculares, como monitorar a dinâmica do crescimento vascular do engenheiro e remodelar durante a cultura de longo prazo. A principal vantagem do uso da tomografia de coerência óptica, ou OCT, é que é uma estratégia de imagem prontamente disponível, em tempo real e não destrutiva para caracterizar as características estruturais e o processo de remodelação dos vasos projetados. Demonstrando o procedimento também estarão Shangmin Liu, e Wentao Ma, técnicos do meu laboratório.
Para iniciar este procedimento, forja o andaime PGA como descrito no protocolo de texto Dip PGA andaimes em um hidróxido de sódio mol-por litro por um minuto, para ajustar a estrutura espacial da malha. Em seguida, mergulhe os andaimes na água de grau de cultura tecidual três vezes por dois minutos cada. Cada vez, bata suavemente o andaime com um papel de tecido.
Em seguida, seque os andaimes em um capô com um soprador por uma hora. Para montar o bioreator e a junção y para imagem OCT, primeiro, mergulhe o bioreator cilíndrico de vidro auto-desenvolvido, andaimes PGA, tubo de silicone, tubos biocompatíveis, conectores, barra de agitação e equipamentos para montagem em um tanque de etanol de 95% por duas horas. Puxe o andaime PGA através dos braços laterais do bioreator conectado a um lado com um conector, bem como para outro lado com a junção y usada para entregar o fio guia OCT.
Monte outro andaime PGA no bioreator da mesma forma. Coloque o politetrafluoroetileno nos lábios bioreatores apertando-o com suturas 4-0. Coloque o bioreator no tanque de etanol novamente por uma hora antes de secá-lo durante a noite em um capô com o soprador ligado.
Agora, isole as células musculares suaves da artéria umbilical humana das artérias umbilicais humanas por técnicas padrão de explanta Na causa de salvar as células em andaimes PGA, evite qualquer gotejamento de suspensão celular na parte inferior do bioreator. Além disso, cubra o bioreator com tampa de silicone-rolha o mais rápido possível após o assento da célula para evitar contaminação. Expanda e mantenha as células em meio de crescimento muscular suave.
Semear as células musculares suaves da artéria umbilical humana a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro no meio de cultura acima nos andaimes PGA. Depois de colocar uma barra de senhor no bioreator, cubra-a com a tampa da rolha de silicone que tem um tubo de alimentação e três segmentos de tubulação curto inseridos para troca de gás. Conecte filtros DE 0,22 mícrons PTFE a cada tubo de mudança de ar e conecte uma tampa de heparina ao tubo de alimentação.
Ajuste a barra de mexida com uma velocidade de agitação de 13 rodadas por minuto. Em seguida, monte o bioreator de vidro, a tampa da rolha de silicone e o andaime PGA no sistema de cultura. Deixe as células aderirem por 45 minutos inclinando o bioreator a cada 15 minutos com um suporte para a esquerda e para a direita.
Agora, conecte a bomba LOO-OH-YEE, saco salino tampão-fosfato e o motorista com os tubos biocompatíveis para criar o sistema de profusão. Abra o motorista para encher os tubos com PBS. Coloque o bioreator geral em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 graus Celsius.
Encha a câmara de cultura com 450 mililitros do meio cultural. Cresça os andaimes semeados sob cultura estática por uma semana, mudando o meio cultural a cada três ou quatro dias aspirando metade do antigo meio através do tubo de alimentação e reabastecendo o reator com uma quantidade equivalente de meio de cultura fresca. Para preparar o sistema de profusão para imagens de OCT, bombeie fluidos no saco PBS para circular através dos tubos biocompatíveis e de volta para o saco.
Abra a potência do driver e regular a configuração da bomba com uma frequência de 60 batidas por minuto e uma pressão sistólica de saída de 120 milímetros de mercúrio. Ajuste os parâmetros mecânicos de acordo com as necessidades da cultura vascular de engenharia tecidual. Clique no botão executar para fazer o sistema de profusão funcionar.
Forneça a simulação de pulsatil para os vasos durante três semanas, pressurizando iterativamente os tubos biocompatíveis após uma semana de cultura estática. Use uma fonte de luz para garantir a resolução axial de dez a vinte mícrons e a profundidade de imagem de um a dois milímetros para identificar a estrutura dos vasos sanguíneos projetados por tecido, ou TEVBs, com base no sistema de imagem intravascular oct de domínio de frequência. Ligue o interruptor de alimentação e abra o software de captura de imagem Conecte o cateter de imagem de fibra óptica ao motor de acionamento e ao controlador óptico, com a função de retirada automática do cateter.
Defina os parâmetros da taxa de aquisição de imagens para dez quadros por segundo, com uma velocidade de pullback automático de dez milímetros por segundo. Agora, conecte o cateter de imagem à junção y através da tampa de heparina com uma agulha calibre 18. Coloque o cateter no tubo de silicone e identifique o aperto da estrutura da malha PGA antes de carregar o andaime PGA no bioreator.
Agora, coloque a ponta do cateter sobre a região de interesse. Ajuste o dispositivo de pullback e verifique se há qualidade de imagem. Adquira imagens em um, quatro, sete, dez, 14, 17, 21 e 28 dias de cultura para cada TEBV individual.
Salve essas imagens sequencialmente com uma observação em tempo real da microestrutura do TEBV, incluindo morfologia superficial, estrutura interna e composição. Repita a medição três vezes para obter uma medição confiável dos vasos projetados cada vez. Capture uma série de imagens ao longo dos testes usando o software de captura de imagem.
Para usar o software de análise de imagem para medir a espessura da parede do vaso sanguíneo projetado por tecido, selecione primeiro a imagem a ser analisada. Em seguida, clique na ferramenta de rastreamento para identificar automaticamente o lado interno do vaso sanguíneo projetado por tecido com o software e esboce manualmente o lado externo. Um diagrama de espessura aparecerá na tela.
Repita a medição por cinco vezes para obter uma medição confiável dos construtos. Considere usar dois investigadores independentes obrigados a obter informações. Abra a tampa da rolha de silicone colocada sobre o bioreator quando a cultura estiver terminada, e descarte o meio de cultura.
Solte o politetrafluoroetileno dos lábios bioreatores e corte os tubos de silicone do lado externo do politetrafluoroetileno com uma tesoura. Colher as TEBVs do bioreator, e cortá-las em seções para um exame de microscopia de elétrons de varredura. Retire o tubo de silicone de suporte e conserte as seções com 4% de formaldeído de potência.
Realizar coloração histológica de rotina com tricromo de masson e vermelho sirioso para examinar a morfologia do colágeno e da PGA. Para avaliar o conteúdo PGA e o componente de colágeno, observe amostras histólógicas com coloração vermelha siriosa através de um microscópio polarizado. As imagens de OCT são comparadas com achados histopatológicos de TEBVs após quatro semanas de cultura.
A imagem de OCT mostra microestrutura compacta e componentes específicos em comparação com a avaliação histológica. O meio de cultura, o tubo de silicone, o TEBV e o fragmento PGA são visíveis. A coloração tricrômica de Masson demonstra fibras de colágeno distribuídas em uma determinada direção, juntamente com os remanescentes de PGA na camada de mídia dos vasos projetados.
A coloração vermelha de Sirius revela remanescentes de PGA e um componente de colágeno usando um microscópio polarizado. Micrografias de elétrons de varredura de vasos projetados demonstram uma microestrutura compacta. Enquanto isso, essa modalidade de imagem intraluminal adota o monitoramento não destrutivo e fácil das TEBVs, incluindo o processo de remodelação e morfologia visual in-situ em cultura de longa duração.
Como mostrado aqui, a remodelagem ocorre anteriormente e as alterações morfológicas se manifestam mais obviamente no grupo dinâmico através da comparação da espessura do TEBV. Essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos vasculares explorarem características estruturais e o processo de remodelação a longo prazo de embarcações projetadas. A exibição clara de remanescentes poliméricos por microscopia polarizada combinada com imagens OCT pode ser útil para avaliar a degradação do andaime.
