Этот метод позволяет легко создавать направляющий РНК-плазмиды для экспериментов с поддержкой CRISPR. Основным преимуществом этого метода является то, что клонирование может быть осуществлено в один шаг и в паре руководство РНК могут быть созданы с помощью одного руководства РНК выражения плазмидов. Чтобы начать этот протокол, разбавить лиофилизированные грунтовки в буфере 1X TE до конечной концентрации 100 микромолелей.
Aliquot равное количество вперед и обратно грунтовки в ПЦР полосы крышка труб. Вихрь смешивать. Далее, спина вниз руководство РНК олигонуклеотидных смесей в 100 раз G в течение 15 секунд.
Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем создать перевязку. Добавьте от одного до пяти микрограммов выбранного вектора экспрессии PSB700 в BSNB1 с использованием 0,5 микролитров BSNB1 на один микрограмм вектора. Добавьте дистиллированную воду до тех пор, пока общий объем не составит 40 микролитров, и проведем пищеварение в течение одного часа при 55 градусах Цельсия.
Вы запустите продукты пищеварения на 1,5%низкий плавления агарозы гель. Вырежьте переваренную векторную позвоночниковую полосу, которая соответствует фрагменту размером примерно 9 килобазы. Перенесите этот ломтик геля в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Используя коммерческий набор для очистки геля, извлекайте ДНК из агарозного геля в соответствии с инструкциями производителя. Затем разбавьте ДНК в 10-15 микролитров буфера TE, чтобы получить концентрированный элют. При готовности к проведению перевязки добавьте в флакон 15 микролитров дистиллированной воды.
Добавьте 1 микролитер ранее анналированного руководства РНК-олигонуклеотидов, один микролитер переваренного вектора экспрессии PSB700 BSNB1 и 2 микролитров буфера реакции лигозы ДНК 10XT4. Затем смешайте это решение с вихрем. Добавьте один микролитер лигозы ДНК и вихря снова.
Спин вниз раствор в 100 раз G в течение 15 секунд. Инкубировать реакции при комнатной температуре в течение ночи убедившись, что включить не вставить негативную реакцию контроля, который имеет BSNB1 переваривается вектор в одиночку без аннелированного руководства РНК олигот вставки. Для начала удалите E.coli из хранилища при температуре минус 80 градусов по Цельсию и оттаивать его на льду в течение 5-10 минут.
Добавьте 0,5 микролитров подготовленной реакционной смеси к восьми микролитров компетентного E.coli. Держите смесь на льду в течение 30 минут. Тепло-шок смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 45 секунд.
Затем дайте смеси отдохнуть на льду в течение двух минут. Используя роторный шейкер, восстановить культуру в 250 микролитров SOC средств массовой информации, используя условия, перечисленные здесь для NEB DH5a или NEB конюшни. После этого пластина 80 микролитров культуры на соответствующей устойчивости к антибиотикам лизогенной бульонной пластины.
Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию для NEB DH5a или при 30 градусах по Цельсию для НЭБ конюшни. Для начала используйте специальный протокол PHusion GC для создания необходимого фрагмента, изложенного в текстовом протоколе. Запустите этот продукт ПЦР на 1%agarose гель и убедитесь, что одна полоса рассматривается примерно в 490 базовых пар.
Использование гель извлечения комплект вырезать и извлечь этот продукт ПЦР. Затем aliquot подготовленный 1X мастер смесь в ПЦР труб. Использование многоканарной пипетки для добавления одного микролитров продукта ПЦР при концентрации 40 фемтомолов на микролитр.
В одном микролитре вектора PSB700 добавляют концентрацию 40 фемтомолов на микролитер. Включите не вставить контроль с помощью одного микролитер воды вместо руководства РНК олигонуклеотидов. Дайджест вектора и ligate вставки в одной реакции с помощью протокола Золотые Ворота, изложенные в текстовом протоколе.
После первоначальной реакции золотых ворот добавьте к каждой реакции дополнительные 0,5 микролитров фермента BSNB1. Продолжить реакцию при 55 градусах по Цельсию в течение одного часа. Когда реакция золотых ворот будет завершена, переходите к ранее описанной процедуре трансформации E.coli.
В этом исследовании с помощью двух методов успешно создаются векторы экспрессии РНК-руководства. В первом методе векторный костяк предварительно переваривается и перевязивается в серии коротких олигонуклеотидов. Второй метод использовал клонирование золотых ворот для одновременного переваривания и лигата в одной реакции.
Парное руководство РНК, выражаю которое выражает векторы, каждый из которых управляется собственным независимым промоутером, успешно создается путем клонирования пользовательского фрагмента ПЦР. Успешное клонирование для любого из этих методов приведет к появлению значительно больше колоний для преобразований с соответствующей вставкой ДНК по сравнению с не вставить контрольную пластину. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы включить не вставить элементы управления в шаг клонирования.
После этой процедуры, другие методы, такие как эпигеном инженерии могут быть выполнены для того, чтобы ответить на вопросы, как то, что последствия хроматина подписи имеют на экспрессию генов.
