Основным преимуществом этого метода является то, что он отражает активность РНК-полимеразы II путем измерения недавно синтезированной мРНК, которые не находятся под влиянием деградации РНК. Этот протокол был первоначально описан с использованием микроаррай гибридизации, но может быть легко принят на высоком протяжении последовательности недавно транскрибированных мРНК. Демонстрацией этой процедуры будет Тиаго Баптиста, бывший аспирант из нашей лаборатории.
После инокуляции клеток S.cerevisiae, вырастить их на ночь при 30 градусах по Цельсию с постоянным возбуждением при 150 об/мин. На следующий день измерьте оптическую плотность на уровне 600 нанометров. Разбавить культуру до OD600 примерно 0,1 в 100 миллилитров YPD среды.
Выращивай клетки до тех пор, пока OD600 не будет около 0,8. После этого, мера OD600 из S.pombe ночь культуры. Разбавить эту культуру до OD600 примерно 0,1 в 500 миллилитров ЯС среды и пусть он растет до OD600 составляет примерно 0,8.
Во-первых, подготовить свежий раствор из двух молярных четырех-thiouracil. Держите подготовленный раствор при комнатной температуре и защищены от света. Добавьте четырехтиурациловый раствор в культуры S.cerevisiae и S.pombe таким образом, чтобы окончательная концентрация была пять миллимолейных.
Инкубировать S.cerevisiae и S.pombe культур при 30 градусов по Цельсию и 32 градусов по Цельсию соответственно с постоянным возбуждением в течение шести минут. После этого удалите небольшую алициту каждой культуры и подсчитайте ячейки, используя либо автоматический счетчик ячеек, либо камеру Нойбауэра. Центрифуга при 2500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, чтобы собрать клетки.
Откажитесь от супернатанта и мыть клетки с ледяной один раз PBS. Центрифуга снова при 2500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Далее, повторного перерасхода клеток в пять миллилитров ледяной один раз PBS.
Смешайте клетки S.cerevisiae и S.pombe в соотношении три к одному. Центрифуга смешанных образцов на 2500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем удалите PBS и вспышки заморозить клетки в жидком азоте.
Храните образец при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию. Когда готовы к работе, оттаивать клетки на льду в течение примерно 20 до 30 минут. Используйте адаптированный комплект извлечения дрожжевой РНК для извлечения РНК, как указано в текстовом протоколе.
После этого перенесите картридж фильтра в трубку окончательной коллекции. Elute РНК с 50 микролитров DEPC-обработанных RNase свободной воды, которая была разогрета до 100 градусов по Цельсию. Центрифуга по 16 000 раз г в течение одной минуты.
Затем используйте 50 микролитров разогретой DEPC-обработанной RNase-свободной воды, чтобы утоить РНК снова в ту же трубку. Центрифуга при 16 000 г в течение одной минуты, убедившись, что весь объем образца прошел через фильтр. Если это не так, центрифуга снова в течение более длительного периода времени.
После завершения количественной оценки и проверки чистоты образца с использованием соответствующего оборудования. Используйте воду без ядра, обработанную DEPC, для регулировки концентрации ранее приобретенной РНК до двух миллиграммов на миллилитр. Aliquot 200 микрограммов общей РНК и нагревать его при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
Немедленно охладите его на льду в течение двух минут. Добавьте 600 микролитров воды, свободной от DEPC RNase. Добавьте 100 микролитров буфера биотинилирования, а затем добавьте 200 микролитров биотина HPDP.
Если раствор биотина HPDP высасывляется из раствора, увеличьте объем DMSO или DMF до 40% от объема реакции, как указано в текстовом протоколе. Защитите образец от света и инкубировать его при комнатной температуре с нежным возбуждением в течение трех часов. После этого добавьте примерно равный объем хлороформа в трубки и энергично перемешайте.
Центрифуга при 13 000 раз г и четыре градуса цельсия в течение пяти минут. Затем тщательно перенесите верхнюю фазу в новые две миллилитровые трубки. Добавьте количество пяти хлорида натрия, равное примерно 1/10 объема образца.
Затем смешайте образец. Во-первых, нагреть биотинилированную РНК при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем охладите образцы на льду в течение пяти минут.
Добавьте 100 микролитров магнитных бусин со стрептавидином в биотинилированную РНК. Инкубировать при комнатной температуре с небольшим встряхивания в течение 90 минут. Поместите колонны, предоставленные комплектом, в магнитную подсюх.
Далее добавьте 900 микролитров буфера для мытья комнатной температуры к столбцам. Нанесите на столбцы 200 микролитровых шариков и РНК-смеси. Соберите поток через 1,5 миллилитров труб, а затем применить его снова к той же магнитной колонке.
Держите этот поток через при необходимости, поскольку он представляет собой необряемую фракцию РНК. Чтобы начать проверку RT-qPCR различных фракций, сначала синтезировать cDNA, как указано в тексте. Затем усилить cDNA в режиме реального времени qPCR с помощью стандартного протокола.
Измеренные уровни транскриптов в фракциях, очищенных от клеток дикого типа, обучаемых с четырьмя тиурацилами и без них, подтвердили, что эта процедура специально очищает помеченную РНК. Анализ штамма дельты spt20 показывает, что количество общей РНК стабильного состояния практически не изменилось или лишь слегка уменьшилось для проверенных генов. Аналогичные результаты видны для штаммов, удаленных для bre1.
Тем не менее, анализ недавно транскрибированных РНК в штамме дельты spt20 показывает трех-пятикратное снижение синтеза мРНК для всех проверенных генов. Между тем, потеря bre1 приводит к более сдержанным, но все еще видимым снижением. После неизгладимого истощения spt7 структурное подразделение комплекса саги, недавно транскрибированные уровни мРНК снижаются до такой степени, как штамм удаления.
Когда общие уровни РНК измеряются с помощью анализа генома в целом, только несколько генов, как видно, их уровни экспрессии изменены при удалении spt20 либо вверх регулирования или вниз регулирования. Тем не менее, анализ недавно транскрибированных РНК показывает, что уровни более 4000 генов значительно снижены по крайней мере в два раза после удаления spt20, что свидетельствует о глобальном положительном влиянии саги на транскрипцию РНК-полимеразы II в начинающих дрожжах. Хотя этот метод может обеспечить понимание транскрипции в Saccharomyces cerevisiae, он был применен только с небольшими вариациями с помощью этого протокола, мы могли бы обнаружить глобальное снижение синтеза мРНК, которая была компенсирована глобальным снижением деградации мРНК.
