Двумерная визуализация микроциркуляторного русла головного мозга крысы со сверхвысоким разрешением с помощью ультразвуковой микроскопии локализации

В данной статье мы описываем протокол ультразвуковой локализационной микроскопии (УЛМ), которая позволяет достичь пространственного разрешения 12,5 мкм для получения изображения микроциркуляторного русла головного мозга у крыс. Он позволяет детально визуализировать направление и скорость кровотока, предлагая мощный инструмент для продвижения исследований мозгового кровообращения и сосудистых заболеваний.

Микроциркуляторное русло головного мозга образует сложную сеть сосудов, необходимых для поддержания функции мозга. Такие заболевания, как инсульт, болезнь Альцгеймера, глиомы и сосудистая деменция, могут глубоко нарушить работу микрососудистой системы. К сожалению, современные методы медицинской визуализации предлагают только косвенные наблюдения в таком масштабе. Ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ), созданная по мотивам оптической микроскопии, преодолевает классический компромисс между глубиной проникновения и пространственным разрешением. Локализуя и отслеживая отдельные введенные микропузырьки (МБ) с субволновой точностью, можно создавать сосудистые карты и карты скоростей в микрометровом масштабе. В этой статье мы представляем надежный протокол визуализации микроциркуляторного русла головного мозга in vivo у крыс со сверхвысоким разрешением с использованием коммерческой ультразвуковой платформы. Этот метод достигает пространственного разрешения 12,5 мкм, реконструируя микрососудистую архитектуру и предоставляя подробную информацию о направлении и скорости кровотока, что значительно расширяет наше понимание микроциркуляции головного мозга. Протокол может быть распространен на модели болезней крыс, предлагая мощный инструмент для ранней диагностики и лечения нейрососудистых заболеваний.

Мозговое микроциркуляторное русло, состоящее из капилляров, артериол и венул, имеет важное значение для поддержания функции мозга, способствуя доставке питательных веществ, кислородному обмену и выведению отходов ^1,2. Сбои в этой сети связаны с неврологическими расстройствами, такими как инсульт³, болезнь Альцгеймера⁴, глиомы⁵ и сосудистая деменция⁶, что приводит к нарушениям физиологии мозга. Микрососудистые изменения часто предшествуют появлению клинических симптомов, что делает их критической мишенью для диагностических и терапевтических вмешательств ^7,8. Всестороннее понимание сосудистых изменений как на структурном, так и на функциональном уровнях является ключом к продвижению исследований и стратегий лечения.

Тем не менее, визуализация микроциркуляторного русла головного мозга особенно сложна из-за небольшого размера и частично глубокого расположения в мозге. Традиционные методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ)⁹ и компьютерная томография (КТ)¹⁰, хотя и достаточны для фиксации крупномасштабных сосудистых изменений, обеспечивают пространственное разрешение (~100 мкм), которое слишком грубо для визуализации мелких сосудов. Оптические методы, такие как двухфотонная микроскопия¹¹ , обеспечивают превосходное пространственное разрешение (до 1 мкм) для изображения отдельных капилляров, но им мешает ограниченное поле зрения и глубина проникновения (менее 1 мм), что ограничивает их способность визуализировать глубокие области мозга. Будучи ультразвуковым методом, допплерография¹², хотя и предлагает оценку кровотока в режиме реального времени, остается ограниченной разрешением 50-200 мкм, что недостаточно для микрососудистой детализации. В целом, ни один метод в настоящее время не удовлетворяет двойному требованию высокого пространственного разрешения и достаточного проникновения в мозг, необходимого для визуализации мозгового микроциркуляторного русла.

Ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ), созданная на основе оптической микроскопии^13,14, позволяет визуализировать мелкие структуры в микронном масштабе, определяя местоположение отдельных введенных микропузырьков (МБ) и отслеживая их смещение с субволновым разрешением¹⁵. Он обходит классический компромисс между проникновением и разрешением при ультразвуковой визуализации¹⁶. В этом исследовании подробно описан надежный протокол для реализации ULM в модели живой крысы и, таким образом, для получения изображений микроциркуляторного русла головного мозга со сверхвысоким разрешением с помощью коммерчески доступной ультразвуковой платформы. Протокол не только обеспечивает комплексную реконструкцию микрососудистой структуры, но и предоставляет подробную информацию о направлении и скорости кровотока, что невозможно при использовании обычных методов визуализации. Несмотря на то, что протокол был валидирован на нормальных крысах, он может быть распространен на модели заболеваний крыс, предлагая возможности для специализированных исследований при различных патологических состояниях.

Все эксперименты на животных, выполненные в этой работе, одобрены Комитетом по этике Фуданьского университета (номер одобрения: 2022JS-004). Протокол строго следует рекомендациям по уходу за животными Фуданьского университета, чтобы обеспечить гуманное обращение с животными. Перед началом эксперимента крысам необходимо предоставить 1-недельный период для экологической акклиматизации, в течение которого они обеспечиваются достаточным количеством корма и воды. Фотопериод тщательно регулируется в соответствии со своими биологическими ритмами для обеспечения поддержания нормальных физиологических состояний. В конце эксперимента проводится эвтаназия с помощью передозировки ингаляционного изофлурана.

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная установка показана на рисунке 1A-H.

1. Подготовка животных к визуализации УЛМ

1. Анестезия
   1. Вызвать анестезию у крысы путем введения смеси 3,5% изофлурана и 100% кислорода со скоростью потока 3 л/мин. Примерно через 4 минуты извлеките животное из камеры и положите его лежа на платформу для визуализации, предварительно нагретую до 37 °C. Подтвердите глубину анестезии отсутствием рефлекса отмены на твердом защемлении пальца задней конечности крысы.
   2. Поместите нос крысы в дыхательную маску, подключенную к системе анестезии. Поддерживайте стабильную седацию путем введения смеси 1,5% изофлурана и 100% кислорода со скоростью потока 1,5 л/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Методы и дозировки анестезии строго соответствуют рекомендациям производителя.
2. Предоперационная подготовка животных
   1. Закрепите верхние резцы крысы в выемке планки резцов, расположив нижнюю челюсть под стержнем. Используйте ушные планки для стабилизации головы крысы, расположив их в костном углублении немного впереди и выше ушного канала (пальпируется рукой), гарантируя, что вся поверхность черепа остается горизонтальной (рис. 1A).
   2. Осторожно прощупайте стабильность фиксации, оказывая небольшое давление на разные части головы. Следите за тем, чтобы не было движения или соскальзывания с исходного положения.
   3. Точно отрегулируйте высоту платформы для визуализации и тщательно отрегулируйте угол наклона головы крысы, поднимая или опуская вырез резцов, чтобы обеспечить беспрепятственное дыхание.
   4. Нанесите эритромициновую мазь или 30% раствор глицерина на глаза крысы, чтобы предотвратить повреждение от длительного воздействия хирургического света и сохранить глаза влажными под анестезией. Кроме того, используйте пинцет с круглым концом, чтобы аккуратно оттянуть язык крысы к одной стороне рта, чтобы предотвратить удушье во время операции.
   5. Используйте ручную электрическую машинку для стрижки и брейте голову крысы против направления роста волос (сзади вперед), обычно между ушами, от глаз до начала шеи (рисунок 1B). Очистите выбритый участок 1% раствором йода, чтобы подготовиться к хирургическому разрезу.
3. Трепанация черепа крыс
   1. Сделайте надрез вдоль сагиттального шва черепа крысы, начиная сразу за затылочной костью и простираясь примерно на 4 см вперед. Используйте гемостатики для втягивания кожи с обеих сторон (рисунок 1C). По желанию, полностью иссекайте кожу над черепом, чтобы обеспечить больший хирургический доступ, но это может увеличить риск инфекции.
   2. С помощью небольших ножниц удалите надкостницу с черепа, полностью обнажив твердый костный слой.
   3. Выполняйте трепанацию черепа с помощью портативного мини-сверла для черепа, оснащенного сферическим сверлом (Рисунок 1D). Начните с грубого сверла (диаметром 2,5 мм) и аккуратно постукивайте, чтобы стереть кость, применяя сверло в течение 2-3 секунд за раз. Начните с центральной области и продвигайтесь к более толстым областям по бокам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное кровотечение во время трепанации черепа влияет на кровообращение, что приводит к отсутствию сосудистой реконструкции в корковых областях (Рисунок 1H).
   4. Делайте паузу каждые 2-3 секунды, чтобы предотвратить перегрев, и каждые 2 минуты вводите примерно 1 мл 0,9% NaCl в область сверления с помощью шприца для охлаждения и смывания мусора.
   5. Если белая костная ткань перестала казаться равномерно связанной, переключитесь на более тонкое сверло (диаметром 1 мм). Продолжайте сверлить до тех пор, пока центральные крупные кровеносные сосуды не станут отчетливо видны темно-коричневого цвета, а окружающая область не станет розовой, а микрососуды будут видны слегка красноватыми (Рисунок 1F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный диапазон трепанации черепа находится от Bregma +3 мм до Lambda спереди-сзади и 7 мм с каждой стороны вдоль средней линии черепа (Рисунок 1E). После завершения операции дайте крысе отдохнуть в течение примерно 10 минут, чтобы обеспечить относительно стабильные физиологические условия, прежде чем начать сбор данных.

2. Настройка перед сбором данных

1. Подготовка и введение контрастного вещества
   1. Растворите контрастное вещество (один флакон, содержащий 59 мг газа SF₆ и 25 мг лиофилизированного порошка) в соответствии с официальными рекомендациями в 5 мл 0,9% NaCl. Энергично встряхните смесь до образования суспензии MB. Конечная концентрация SF₆ в суспензии составляет 8 мкл/мл.
   2. Наберите 0,8 мл суспензии MB в шприц объемом 1 мл и закрепите его в микроинъекционном насосе, запрограммированном на инфузию со скоростью 100 мкл/мин.
   3. Введите иглу 26 G с прикрепленным катетером в хвостовую вену крысы (Рисунок 1G).
2. Выбор плоскости изображения
   1. Установите зонд с центральной частотой 15,625 МГц на манипуляторную руку стереотаксического инструмента для головного мозга, оснащенную зажимом (диапазон перемещения: вертикальный, горизонтальный, передне-задний до 80 мм; точность считывания: 0,1 мм).
   2. Расположите ультразвуковой зонд непосредственно над мозгом крысы, подвергшегося воздействию. Нанесите соединительный гель на открытую поверхность мозга, чтобы обеспечить оптимальную передачу сигнала.
   3. Откройте основной интерфейс программного обеспечения, который объединяет атлас мозга крысы с программами управления моторными движениями.
   4. Установите точку Брегмы в качестве начала координат. Программный интерфейс обеспечивает отображение траектории зонда в режиме реального времени и соответствующего местоположения среза мозга крысы. Выберите целевую плоскость изображения; например, Брегма -1 мм.

3. Сбор данных (Тайминг ~ 20 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Verasonics (ультразвуковая система) предоставляет оригинальные сценарии MATLAB для использования с системой Vantage и не был изменен.

1. Запуск программного обеспечения
   1. Запустите программное обеспечение MATLAB 2021a.
   2. Введите скрипт сбора данных в MATLAB 2021a.
   3. В корневом каталоге введите activate в окне командной строки, чтобы активировать среду выполнения.
2. Конфигурирование параметров и сбор радиочастотных сигналов
   1. Установите начальную и конечную глубины сбора данных на длинах волн 5 и 120 соответственно, чтобы эффективно захватить интересующую область.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировки должны производиться в зависимости от плоскости визуализации и конкретного изучаемого животного.
   2. Установите углы поворота плоской волны от -5° до 5° с шагом 2,5° для повышения разрешения и контрастности изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте эти параметры в зависимости от конкретных требований к изображению и характеристик объекта.
   3. Установите напряжение передачи на 20 В, чтобы обеспечить достаточное проникновение и оптимальное соотношение сигнал/шум для интересующей области.
   4. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать сбор данных и сохранить радиочастотные (РЧ) сигналы в формате .mat.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните сбор данных через 30 секунд после запуска микроинжекционного насоса, чтобы обеспечить равномерное и стабильное распределение MB в организме крысы.

4. Обработка и анализ данных (Тайминг ~ 8 ч)

1. Обработка данных
   1. Импортируйте радиочастотные данные в MATLAB 2021a и демодулируйте их для генерации синфазных и квадратурных (I/Q) данных (см. Таблицу материалов).
   2. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы использовать алгоритм Delay-and-Sum (DAS) для формирования диаграммы направленности на данные I/Q (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота кадров после компаундирования составляет 800 Гц, всего 120 000 кадров.
2. Визуализация УЛМ
   1. Примените алгоритм пространственно-временной фильтрации¹⁷ с помощью разложения сингулярных значений (SVD) к данным IQ, чтобы удалить фоновый шум и беспорядок. Каждые 800 кадров хранятся в виде блока данных, а порог SVD устанавливается равным [15, 800].
   2. Определите местоположение центра каждой МБ с помощью алгоритма гауссова аппроксимации¹⁸.
   3. Используйте алгоритм Куна-Манкреса для отслеживания траекторий MB на последовательных кадрах на основе их положения (см. Таблицу материалов).
   4. Сопоставьте траектории MB с 8-кратной увеличенной дискретизацией, используя горячую цветовую карту для отображения количества траекторий MB и струйную цветовую карту для кодирования скорости потока путем отображения рассчитанной скорости в каждой позиции в микроциркуляторном русле.
   5. Примените пользовательскую цветовую схему, чтобы различать направления восходящего и нисходящего потока, что приведет к получению изображений с высоким разрешением для улучшенной визуализации.
   6. Случайным образом разделите исходные траектории MB на две группы, чтобы создать два подобраза, выполните преобразование Фурье для каждого из них и вычислите кольцевую корреляцию Фурье (FRC) как нормализованную корреляцию их спектров. Определите разрешение как обратное пространственной частоте, где FRC падает ниже порогового значения¹⁹.

На рисунке 1 показана подробная схема визуализации микрососудистой УЛМ головного мозга in vivo у крыс, при этом каждый элемент тщательно спроектирован для минимизации экспериментальной вариабельности и обеспечения точного сбора данных для получен...

В этом протоколе ULM был успешно использован для выполнения визуализации микроциркуляторного русла мозга крысы in vivo со сверхвысоким разрешением. По сравнению с другими методами визуализации, ULM одновременно учитывает как пространственное разрешение, так и глубину пр?...

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была частично поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая в рамках гранта 2023YFC2410903, Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 12274092, 12034005), Исследовательской программой Шанхая (грант 21TS1400200), Международной программой научно-технического сотрудничества Шанхая (грант 24490710400) и Фондом искусственного интеллекта для науки Фуданьского университета (грант FudanX24AI016).