超音波ローカリゼーション顕微鏡を用いたラット脳微小血管系の2次元超解像可視化

ここでは、ラットの脳微小血管系を画像化するために12.5μmの空間分解能を達成する超音波局在顕微鏡(ULM)のプロトコルについて説明します。血流の方向や速度を詳細に可視化し、脳循環や血管疾患の研究を進めるための強力なツールを提供します。

大脳の微小血管系は、脳の機能を維持するために不可欠な血管の複雑なネットワークを形成しています。脳卒中、アルツハイマー病、神経膠腫、血管性認知症などの病気は、微小血管系を深く混乱させる可能性があります。残念ながら、現在の医用画像モダリティは、このスケールで間接的な観察しか提供していません。光学顕微鏡に着想を得た超音波局在顕微鏡(ULM)は、浸透深さと空間分解能の間の古典的なトレードオフを克服します。注入された個々のマイクロバブル(MB)をサブ波長の精度で位置特定および追跡することにより、血管および速度マップをマイクロメートルスケールで生成できます。ここでは、市販の超音波プラットフォームを使用して、ラットの脳微小血管系を in vivo で超解像イメージングするための堅牢なプロトコルを紹介します。この手法は、12.5μmの空間分解能を達成し、微小血管の構造を再構築し、血流の方向と速度に関する詳細な情報を提供することで、脳の微小循環の理解を大幅に向上させます。このプロトコルはラット疾患モデルに拡張することができ、神経血管疾患の早期診断と治療のための強力なツールを提供します。

大脳の微小血管系は、毛細血管、細動脈、細静脈から構成され、栄養の送達、酸素交換、老廃物の除去を促進することで脳の機能を維持するために不可欠です^1,2。このネットワークの混乱は、脳卒中³、アルツハイマー病⁴、神経膠腫⁵、血管性認知症⁶などの神経障害に関与しており、脳生理機能の障害につながります。微小血管の変化は、臨床症状の発症に先行することが多いため、診断および治療介入の重要な標的となっています^7,8。血管の変化を構造レベルと機能レベルの両方で包括的に理解することは、研究と治療戦略を進めるための鍵となります。

しかし、脳の微小血管系のイメージングは、脳のサイズが小さく、脳内の部分的に深い位置にあるため、特に困難です。磁気共鳴画像法(MRI)⁹ やCT(CT)¹⁰などの従来の画像診断法は、大規模な血管変化を捉えるには十分ですが、小さな血管を視覚化するには粗すぎる空間分解能(~100μm)を提供します。二光子顕微鏡^法11 のような光学的手法は、個々の毛細血管を画像化するための優れた空間分解能(1μmまで)を提供しますが、視野や浸透深度が1mm未満という制限によって妨げられ、脳深部領域を画像化する能力が制限されます。超音波ベースの技術として、ドップ^ラー12はリアルタイムの血流評価を提供しますが、50〜200μmの解像度に制約されたままであり、微小血管の詳細には不十分です。全体として、現在、脳微小血管系イメージングに必要な高い空間分解能と十分な脳浸透という2つの要件を満たす単一の方法はありません。

光学顕微鏡^13,14に触発されて、超音波局在顕微鏡(ULM)は、個々の注入されたマイクロバブル(MB)を特定し、サブ波長分解能¹⁵でそれらの変位を追跡することにより、ミクロンスケールでの微細構造の視覚化を可能にする。これは、超音波画像¹⁶における浸透と解像度の間の古典的な妥協点を回避します。この研究では、生きたラットモデルにULMを実装し、それによって市販の超音波プラットフォームを通じて脳の微小血管系の超解像イメージングを可能にするための堅牢なプロトコルについて詳しく説明します。このプロトコルは、微小血管構造の包括的な再構築を提供するだけでなく、従来のイメージング技術では不可能だった血流の方向と速度に関する詳細な情報も提供します。このプロトコルは正常なラットで検証されましたが、ラットの疾患モデルに拡張可能であり、さまざまな病理学的条件でのカスタマイズされた研究の可能性を提供します。

本研究で実施される動物実験は、すべて復旦大学倫理委員会(承認番号:2022JS-004)によって承認されています。このプロトコルは、動物の人道的な扱いを確保するために、復旦大学の動物飼育ガイドラインに厳密に従っています。実験開始に先立ち、ラットには1週間の環境順応期間を与えられ、その間に十分な飼料と水が与えられます。日長は、正常な生理学的状態の維持を確保するために、それらの生物学的リズムに従って慎重に調節されます。実験の終わりに、吸入されたイソフルランの過剰摂取を使用して安楽死が行われます。

注:実験のセットアップを図1A-Hに示します。

1. ULMイメージングのための動物調製

1. 麻酔
   1. 3.5%イソフルランと100%酸素の混合物を3 L /分の流量で投与することにより、ラットに麻酔を誘発します。約4分後、動物をチャンバーから取り出し、37°Cに予め温めたイメージングプラットフォームに伏せて置きます。 麻酔の深さは、ラットの後肢のしっかりとしたつま先のつま先つまみに離脱反射がないことによって確認されます。
   2. 麻酔システムに接続された呼吸マスクにラットの鼻を置きます。1.5%イソフルランと100%酸素の混合物を1.5L / minの流量で投与することにより、安定した鎮静を維持します。.
      注:麻酔の方法と投与量は、製造元のガイドラインに厳密に従っています。
2. 手術前の動物の準備
   1. ラットの上顎切歯を切歯棒の切り欠きに固定し、下顎を歯棒の下に配置します。耳バーを使用して、ラットの頭を耳道のわずかに前方で上方の骨のくぼみに配置し(手で触診可能)、頭蓋表面全体が水平に保たれるようにします(図1A)。
   2. 頭のさまざまな部分に少量の圧力を加えることにより、固定の安定性を静かに探ります。元の位置から動かったり、滑り落ちたりしていないことを確認してください。
   3. イメージングプラットフォームの高さを微調整し、切歯バーのノッチを上げ下げしてラットの頭の角度を細心の注意を払って調整し、呼吸を妨げないようにします。
   4. エリスロマイシン軟膏または30%グリセリン溶液をラットの眼に塗布して、手術用光への長時間の曝露による損傷を防ぎ、麻酔下で目を湿らせます。.さらに、丸いピンセットを使用してラットの舌を口の片側にそっと引っ張り、手術中の窒息を防ぎます。
   5. ハンドヘルド電動クリッパーを使用して、ラットの頭を毛の成長方向(後ろから前へ)に対して、通常は耳の間、目から首の始まりまで剃ります(図1B)。剃った部分を1%ヨウ素溶液で洗浄し、外科的切開の準備をします。
3. ラット開頭術
   1. ラットの頭蓋骨の矢状縫合糸に沿って、後頭骨のすぐ後ろから開始し、前方に約4cm伸びる切開を行います。止血剤を使用して、両側の皮膚を引っ込めます(図1C)。必要に応じて、頭蓋骨の上の皮膚を完全に切除して、外科的アクセスを増やしますが、これにより感染のリスクが高まる可能性があります。
   2. 小さなハサミを使用して頭蓋骨から骨膜を取り除き、硬い骨層を完全に露出させます。
   3. 球形ドリルビットを装備したハンドヘルドミニ頭蓋ドリルを使用して開頭術を行います(図1D)。粗いドリルビット(直径2.5 mm)から始めて、軽くたたいて骨を削り、一度に2〜3秒間ドリルを適用します。中央のエリアから始めて、側面の厚いエリアに向かって進みます。
      注:開頭術中の過度の出血は血液循環に影響を与え、皮質領域の血管再建が欠如します(図1H)。
   4. 過熱を防ぐために2〜3秒ごとに一時停止し、2分ごとにシリンジを使用して約1 mLの0.9%NaClを掘削エリアに注入して冷却し、破片を洗い流します。
   5. 白骨組織が一貫して接続されているように見えなくなったら、より細いドリルビット(直径1 mm)に切り替えます。中央の主要な血管が暗褐色ではっきりと見えるようになり、周囲がピンク色に見え、微小血管がわずかに赤みがかった色で見えるまで、穴あけを続けます(図1F)。
      注:最終的な開頭術の範囲は、ブレグマ+3 mmから前後のラムダまで、頭蓋骨の正中線に沿って両側に7 mmです(図1E)。手術終了後、ラットを約10分間休ませて、比較的安定した生理学的状態を確認してから、データ収集を開始します。

2. データ収集前の設定

1. 造影剤の調製と注射
   1. 造影剤(59 mgのSF₆ ガスと25 mgの凍結乾燥粉末を含む1つのバイアル)を、公式ガイドラインに従って、5 mLの0.9%NaClに溶解します。混合物を激しく振とうしてMB懸濁液を形成します。懸濁液中の_SF6 の最終濃度は8μL/mLです。
   2. 0.8 mLのMB懸濁液を1 mLシリンジに引き込み、100 μL/minで注入するようにプログラムされたマイクロインジェクションポンプに固定します。
   3. ラットの尾静脈にカテーテルを取り付けた26G留置針を挿入します(図1G)。
2. 撮像面の選択
   1. 脳定位固定装置のマニピュレーターアームに中心周波数15.625MHzのプローブを取り付け、クランプ(移動範囲:垂直、水平、前後最大80mm、読み取り精度:0.1mm)を装備。
   2. 超音波プローブを露出したラットの脳の真上に配置します。露出した脳表面にカップリングゲルを塗布して、最適な信号伝達を確保します。
   3. ラット脳アトラスと運動運動制御プログラムを統合するソフトウェアのメインインターフェイスを開きます。
   4. Bregma ポイントを原点として設定します。ソフトウェアインターフェースは、プローブの軌跡と対応するラットの脳スライスの位置をリアルタイムで表示します。ターゲットイメージング平面を選択します。たとえば、Bregma -1 mmです。

3. データ収集 (タイミング~20分)

注:Verasonics(超音波システム)は、Vantageシステムで使用するための元のMATLABスクリプトを提供しており、変更されていません。

1. ソフトウェアの起動
   1. MATLAB 2021a ソフトウェアを起動します。
   2. MATLAB 2021a でデータ収集スクリプトを入力します。
   3. ルート・ディレクトリーで、コマンド・ライン・ウィンドウに activate と入力して、ランタイム環境をアクティブにします。
2. パラメータ設定とRF信号の集録
   1. データ収集の開始深度と終了深度をそれぞれ 5 波長と 120 波長に設定して、関心領域を効果的にキャプチャします。
      注:調整は、イメージング面と研究対象の特定の動物に基づいて行う必要があります。
   2. 平面波の伝送ステアリング角度を-5°から5°まで2.5°刻みで設定して、画像の解像度とコントラストを向上させます。
      注意: これらの設定は、特定のイメージング要件とターゲット特性に基づいて調整します。
   3. 送信電圧を20Vに設定して、対象領域の適切な浸透と最適な信号対雑音比を確保します。
   4. [Run] ボタンをクリックしてデータ収集を開始し、無線周波数 (RF) 信号を .mat ファイル形式で保存します。
      注:ラットの体内で均一で安定したMB分布を確保するために、マイクロインジェクションポンプを開始してから30秒後にデータ収集を開始します。

4. データ処理と分析 (タイミング ~ 8 時間)

1. データ処理
   1. RF データを MATLAB 2021a にインポートし、復調して同相および直交 (I/Q) データを生成します ( 材料の表を参照)。
   2. [Run] ボタンをクリックして、I/Q データのビームフォーミングに Delay-and-Sum(DAS)アルゴリズムを利用します( 材料の表を参照)。
      注:コンパウンディング後のフレームレートは800 Hzで、合計120,000フレームです。
2. ULMイメージング
   1. 特異値分解 (SVD) 時空間フィルタリング アルゴリズム¹⁷ を IQ データに適用して、バックグラウンド ノイズと乱雑さを取り除きます。各 800 フレームはデータ ブロックとして格納され、SVD しきい値は [15, 800] に設定されます。
   2. ガウス近似アルゴリズム¹⁸を使用して各MBの中心を見つけます。
   3. Kuhn-Munkresアルゴリズムを利用して、位置に基づいて連続するフレーム間でMBの軌跡を追跡します( 資料の表を参照)。
   4. MB軌道を8倍アップサンプリンググリッドにマッピングし、ホットカラーマップを使用してMB軌道の数を表示し、ジェットカラーマップを使用して微小血管系内の各位置で計算された速度をマッピングすることにより流速をエンコードします。
   5. カスタムカラースキームを適用して上向きと下向きの流れ方向を区別し、高解像度の画像を作成して視覚化を強化します。
   6. 元のMB軌道をランダムに2つのグループに分割して2つのサブイメージを作成し、それぞれでフーリエ変換を実行し、スペクトルの正規化された相関としてフーリエリング相関(FRC)を計算します。解像度は、FRC がしきい値¹⁹ を下回る空間周波数の逆数として定義します。

図1は、ラットにおける in vivo 脳微小血管ULMイメージングの詳細なセットアップを示しており、各要素は実験のばらつきを最小限に抑え、信頼性の高い超解像イメージング結果を得るために正確なデータ取得を確保するように慎重に設計されています。

図2A は、ラット脳の微小血管系のULM再構成...

このプロトコルは、ULMを利用して、in vivoラット脳微小血管系の超解像イメージングに成功しました。他のイメージングモダリティと比較して、ULMは空間分解能と透過深度の両方に同時に対応します。ばく露したラットの脳は、頭蓋骨ではなく画像化されたため、骨の存在による減衰や歪みが回避されました。中心周波数15.625MHzのトランスデューサーの下で、約12mmの?...

著者は何も開示していません。

この研究は、Grant 2023YFC2410903 に基づく National Key Research and Development Program of China、National Natural Science Foundation of China (Grants 12274092, 12034005)、Explorer Program of Shanghai (Grant 21TS1400200)、International Science and Technology Cooperation Program of Shanghai (Grant 24490710400)、および AI for Science Foundation of Fudan University (Grant FudanX24AI016) の支援を受けました。