Оптимизация доставки внеклеточных везикул с помощью каркаса с 3D-биопечатью для лечения хронических ран

В этом исследовании представлен протокол изготовления каркасов с 3D-биопечатью в оболочке ядра для заживления хронических ран. Внеклеточные везикулы выделяют из мезенхимальных стволовых клеток и загружают в ядро (альгинат) оболочку, состоящую из карбоксиметилцеллюлозы и альгинатлиазы. Такая конструкция позволяет контролировать деградацию скаффолда и эффективно выпускать электромобили.

В этом исследовании изложен подробный протокол изготовления каркасов с 3D-биопечатью, предназначенных для улучшения заживления хронических ран. Протокол включает выделение внеклеточных везикул (ВВ) из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), известных своими регенеративными и иммуномодулирующими свойствами. Затем эти электромобили встраиваются в уникальную конструкцию каркаса. Каркас имеет сердцевину, состоящую из альгината, загруженного EV, окруженную оболочкой из карбоксиметилцеллюлозы и альгинатлиазы. Эта инновационная конструкция обеспечивает контролируемую деградацию каркаса, способствуя эффективному и контролируемому выбросу электромобилей в месте раны. Протокол охватывает ключевые этапы, включая подготовку и определение характеристик электромобилей, разработку биочернил для 3D-биопечати и оптимизацию параметров печати для достижения желаемой архитектуры ядра-оболочки. Сочетая в себе структурную целостность и биологическую активность, каркас направлен на устранение ограничений обычных повязок для ран, предлагая целенаправленный подход к ускорению регенерации тканей и уменьшению воспаления в хронических ранах. Этот метод обеспечивает воспроизводимую и масштабируемую стратегию для разработки передовых биоматериалов с потенциальным клиническим применением в лечении хронических ран. В протоколе также освещаются критически важные соображения для достижения стабильных результатов, обеспечивая адаптируемость к будущим терапевтическим приложениям.

Хронические раны, часто связанные с чрезмерным воспалением, требуют своевременного лечения для предотвращения серьезных осложнений, таких как инфекции и некроз тканей, которые могут привести к ампутациям. Несмотря на достижения, современные методы лечения остаются дорогостоящими, неудобными, имеют побочные эффекты и ограниченную эффективность, что подчеркивает потребность в более лечебных повязках ^1,2,3. Разработка нового поколения повязок для ран, специально предназначенных для хронических ран, имеет важное значение для решения этих проблем. Кроме того, сложный характер заживления ран требует перевязочных материалов с целым рядом свойств, включая увлажнение, гибкость, адгезию, биологическую активность и биоразлагаемость⁴. Это исследование направлено на разработку биоинженерной раневой повязки, которая объединяет внеклеточные везикулы (EV) с каркасом, напечатанным на 3D-биопринтере, для обеспечения контролируемой терапевтической среды и ускорения заживления хронических ран.

ВВ, полученные из стволовых клеток, способствуют заживлению хронических ран, способствуя противовоспалительным реакциям, росту клеток, миграции и образованию кровеносных сосудов⁵. Кроме того, ВВ могут доставлять биологически активные молекулы, в том числе низкомолекулярные препараты, гены и белковые конструкции для лечения хронических ран⁶. Кроме того, их способность защищать груз от ферментативного разложения повышает стабильность и биодоступность терапевтических агентов, предлагая явные преимущества по сравнению с обычными факторами роста и низкомолекулярными препаратами, которые часто быстро разлагаются in vivo⁷. Несмотря на эти преимущества, эффективная и устойчивая доставка ВВ к тканям-мишеням остается серьезной проблемой.

Каркасы для 3D-биопечати могут служить платформой для доставки электромобилей для усиления их терапевтического эффекта⁸. Эти каркасы имитируют естественную клеточную среду и позволяют осуществлять контролируемое высвобождение EV ^9,10. Они также защищают ВВ от деградации, повышая стабильность их микроРНК и белков¹¹. Хан и др. продемонстрировали, что электромобили могут быть эффективно высвобождены из 3D-биопечатных скаффолдов GelMA. Это высвобождение привело к улучшению прикрепления клеток и усилению экспрессии генов, связанных с путями механотрансдукции в мезенхимальных стволовых клетках буккального жирового пакета человека (hBFP-MSCs), засеянных на каркасы¹². Born et al., оптимизируя концентрацию сшивающего агента, добились контролируемого высвобождения EV. Этот подход продемонстрировал свою эффективность в стимулировании ангиогенеза и является перспективным методом регулируемой доставки^ВВ13.

3D-биопечать сердцевины позволяет создавать сложные структуры из нескольких материалов путем печати материала сердцевины, заключенного в оболочку. Ядро может включать клетки, факторы роста или лекарства, в то время как оболочка обеспечивает механическую поддержку и защиту или действует как барьер. Этот метод находит применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине, таких как разработка сосудистых сетей, имитация естественных тканевых структур и создание систем доставки лекарств. Это позволяет точно контролировать распределение и состав материала, повышая функциональность и биологическую значимость конструкций. По сравнению с альтернативными методами, 3D-биопечать с помощью стержневой оболочки обеспечивает точный контроль над распределением и составом материала, улучшая функциональность и биологическую значимость конструкций^14,15.

Искусственная деградация раневых повязок дает такие преимущества, как снижение дискомфорта во время изменений, влажная среда для заживления и контроля инфекций, своевременная терапевтическая доставка и оптимальная регенерация тканей 16,17,18. Альгинатные (Alg) и карбоксиметилцеллюлозные (CMCh) гидрогели биосовместимы и эффективны для доставки внеклеточных везикул (EV) в раны, способствуя заживлению за счет клеточной коммуникации и уменьшая воспаление¹⁸. В этом исследовании ВВ были интегрированы в ядро Alg, в то время как оболочка из CMCh и AlgLyase (AlgLyase) использовалась для обеспечения быстрой деградации повязки и доставки ВВ. Такая конструкция стержня и оболочки способствует быстрому высвобождению EV в ответ на деградацию каркаса, повышая их терапевтическую эффективность и устраняя ограничения существующих методов лечения хронических ран. Основной целью данного исследования является разработка биоинженерной повязки, которая улучшает заживление ран за счет интеграции контролируемого высвобождения ВВ с быстро разлагаемым каркасом, что в конечном итоге улучшает результаты лечения хронических ран.

Исследования на животных проводились в полном соответствии с этическими стандартами, установленными Национальным комитетом по биоэтике и Комитетом по этике животных Университета Низвы. Этическое одобрение для этого исследования было предоставлено в соответствии с допуском ID: VCGSR, AREC/01/2023. Все животные содержались в стандартных лабораторных условиях, обеспечивая оптимальный контроль окружающей среды, надлежащее питание и всесторонний уход для обеспечения их благополучия на протяжении всего исследования. Все процедуры с участием животных строго соответствовали политике учреждения, международным стандартам ухода за животными и рекомендациям ARRIVE.

1. Культура клеток

1. Достаньте флакон с МСК (отрывок #2) из хранилища жидкого азота и обращайтесь с ним с помощью асептических методов, чтобы предотвратить загрязнение. Быстро разморозьте клетки на водяной бане при температуре 37 °C, убедившись, что удалите их, как только останется небольшой фрагмент льда.
2. Приготовьте полноценную среду, включающую базальную среду MSC SFM, с добавлением 1% (v/v) добавки MSC SFM XenoFree, 1% (v/v) GlutaMAX и 0,01% (v/v) гентамицина. Добавьте в флакон 1 мл предварительно подогретой (37 °C) готовой среды со скоростью от 3 до 5 капель каждые 5 с, а затем аккуратно перемешайте. Переложите все содержимое флакона MSC в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл предварительно подогретой полной среды, в асептических условиях в шкафу биобезопасности класса II.
3. Центрифугируйте ячейки при давлении 200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что центрифуга правильно сбалансирована.
4. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл предварительно подогретой полной среды. Затем переложите клетки в колбу T25, содержащую 4 мл готовой среды.
5. Осторожно наклоните колбу, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек. Инкубируйте колбу при 37 °C с 5%_CO2.
6. Меняйте среду каждые 2 дня, заменяя ее свежей, предварительно подогретой, готовой средой. Используйте щадящее пипетирование, чтобы избежать разрушения клеток. По достижении 70%-80% конфлюенции аспирируйте отработанную среду из колбы Т25.
7. Промойте клетки 3 мл свежего PBS для удаления остатков. Обеспечьте полное покрытие колбы во время стирки.
8. Добавьте в колбу Т25 1 мл 0,25% раствора трипсина, инкубируйте при 37 °С в течение 3-7 мин и внимательно следите за отслоением под микроскопом при 4-кратном увеличении.
9. При необходимости осторожно постучите по колбе, чтобы обеспечить полное отделение ячейки. Добавьте предварительно подогретую среду в колбу и проводите пипеткой вверх и вниз по поверхности, чтобы помочь отделить ячейки. Затем переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
10. Центрифугируйте пробирку при давлении 200 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Суспендируйте клеточную гранулу в свежей полноценной среде и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра Нейбауэра. Переложите ячейки в колбу T75. Обеспечьте плотность посева 5 000 клеток/^см2 для оптимального роста.
11. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2. После 72 ч инкубации клеток соберите кондиционированную среду из клеток для выделения ВВ. Используйте сразу после сбора.

2. Изоляция электромобилей

1. Центрифугируйте 13 мл собранной кондиционированной среды при давлении 800 x g в течение 15 мин для удаления клеточного мусора. Аккуратно отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм, чтобы удалить крупные частицы.
2. Добавьте 5 мл буфера для осадков в отфильтрованную кондиционированную среду и тщательно перемешайте. Убедитесь, что раствор однороден.
3. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы электромобили выпали в осадок. Центрифугируйте смесь при давлении 3 220 x g в течение 30 мин при 20 °C. Проверьте баланс трубок.
4. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Снова центрифугируйте гранулу при давлении 3 220 x g в течение 5 с, чтобы удалить остатки жидкости.
5. Осторожно нанесите гранулу EV в 200 мкл PBS, чтобы избежать повреждения EV. Измерьте концентрацию белка EVs, следуя инструкциям производителя (набор для анализа белка BCA).
6. Выполните вестерн-блоттинг для выявления маркеров, специфичных для ЭВ (CD63, CD81 и CD9), чтобы подтвердить фенотип^{ВВ 18}. Анализ подтвердил наличие этих маркеров, подтвердив принадлежность электромобилей¹⁹.
7. Чтобы свести к минимуму риск заражения РНКазой, рекомендуется использовать ее непосредственно без дополнительного хранения. В случае необходимости храните электромобили при температуре -80 °C для дальнейшего использования. Аликвотируйте суспензию электромобилей в объеме 40 μл, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.

3. Маркировка электромобилей с помощью PKH-26

1. Подготовка буфера
   1. Растворите 0,238 г HEPES примерно в 90 мл стерильной сверхчистой воды в стерильной емкости. Используйте свежеприготовленный раствор HEPES. Добавьте в раствор HEPES 0,85 г NaCl.
   2. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 М NaOH или HCl, в зависимости от необходимости, с помощью откалиброванного pH-метра. Добавьте деионизированную воду, чтобы довести общий объем до 100 мл. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм для его стерилизации.
2. Разведите 4 мкл красителя PKH-26 в 1 мл приготовленного буфера. Тщательно перемешайте пипеткой, чтобы обеспечить однородность.
3. Ресуспендируйте очищенные ВВ в 1 мл PBS в концентрации 700 мкг/мл. Добавьте 1 мл суспензии ЭВ в 1 мл приготовленного раствора ПХ-26. Для контрольной группы, в которой используются только красители, добавьте 1 мл полной среды без EV в 1 мл раствора PKH-26. Все последующие шаги выполняются и для контрольной группы, чтобы учесть потенциальную неспецифическую агрегацию или образование мицелл.
4. Тщательно перемешайте электромобили, аккуратно перевернув трубку в 10-15 раз. Инкубируйте смесь в течение 3-5 минут при комнатной температуре, обеспечивая равномерное воздействие красителя на EV.
5. Приготовьте 2 мл свежего 1% раствора BSA с использованием стерильной сверхчистой воды и добавьте его к 2 мл полученной смеси для гашения реакции мечения. Аккуратно перемешайте, чтобы предотвратить агрегацию.
6. Концентрируйте электромобили с маркировкой PKH-26 в соответствии с вышеуказанным протоколом (шаги 2.2-2.7). Ресуспендируйте маркированные электромобили в 300 мкл PBS. Пипеткой нанесите образец EVs с маркировкой PKH-26 в пробирку с фильтром емкостью 30 кДа.
7. Центрифугируйте образец при 3 220 x g в течение 30 мин при 4 °C. На этом этапе свободный краситель PKH-26 и малые молекулы будут проходить через мембрану в фильтрат, в то время как меченые PKH-26 EV будут удерживаться в ретентате.
8. После первоначального центрифугирования выбросьте фильтрат и добавьте в ретентат 300 мкл PBS. Аккуратно ресуспендируйте электромобили в PBS, пипетируя вверх и вниз.
9. Снова центрифугируйте образец при 3 220 x g в течение 30 минут при 4 °C, чтобы смыть оставшийся свободный краситель или мелкие молекулы.
10. Подтвердите отсутствие PKH-26 в растворе фильтрата с помощью флуоресцентного микроскопа. Если обнаружен какой-либо краситель, повторите шаги стирки.
11. Соберите верхний раствор с помощью микропипетки и снимите фильтр со сборной трубки. Аккуратно переверните фильтр (переверните его вверх дном).
12. Центрифугируйте инвертированный фильтр при давлении 800 x g в течение 5 минут при 4 °C. Это поможет собрать оставшиеся ПХ-26-ЭВ с фильтрующей мембраны в новую сборную трубку. Используйте PKH-26-EV непосредственно для следующего шага.

4. 3D Биопечать

1. Препарат Bioinks
   1. Приготовьте свежий 4,5% (масс./об.) раствор натрия Alg в стерильной сверхчистой воде. Перемешайте в течение ночи при температуре 60 °C, чтобы раствор полностью растворился.
   2. Растворите CMCh в стерильной сверхчистой воде до получения раствора 3,8% (w/v). Готовьте свежие. Перемешайте в течение ночи при температуре 60 °C до полного растворения.
   3. Центрифугируйте приготовленные биочернила при температуре 3 220 x g в течение 10 минут при 25°C, чтобы удалить любые пузырьки, которые могут помешать процессу печати.
   4. Смешайте приготовленные 3 мл раствора Alg с маркированными EV или контролем только красителя с помощью шприцевого смесителя до достижения концентрации EV 0,01% (w/v). Обеспечьте равномерное распределение путем бережного перемешивания.
   5. С помощью шприцевого миксера смешайте 1 мл КМЧ со свежеприготовленным раствором АльгЛиазы в стерильной сверхчистой воде до достижения конечной концентрации 0,5 мЕд/мл.
2. Как показано на рисунке 1A, одновременно загрузите биочернила Alg/Exo в основную часть и биочернила CMCh/AlgLyase в часть оболочки шприца с керном/оболочкой.
3. Перед печатью дайте биочернилам отдохнуть в течение 15 минут.
4. Настройка 3D-биопринтера
   1. С помощью программного обеспечения 3D-биопринтера создайте структуру каркаса, выбрав цилиндрическую форму с диагональным заполнителем. Для этого установите диаметр и высоту цилиндра на 20 мм, и 1,1 мм соответственно. Отрегулируйте размер пор на 1 мм.
   2. Установите скорость откачки сердцевины и форсунки оболочки на 1 мм/с при толщине 0,25 мм на слой и установите скорость перемещения на 6 мм/с. Напечатайте четыре слоя толщиной 0,25 мм каждый при комнатной температуре.
5. Начните печатать на полиэфирной пленке.
6. Используйте увлажнитель с аэрозольным хлоридом кальция (2,2%) для сшивания каркаса в процессе экструзии. Расположите сопло увлажнителя на расстоянии примерно 20 см от экструзионной головки, чтобы обеспечить эффективную сшивку без ущерба для конструкции каркаса. Для дальнейшего сшивания скаффолд погрузить в раствор хлорида кальция (2,2%) на 10 мин.
7. Промойте каркас 3 раза стерильной ультрачистой водой, чтобы удалить избыток хлорида кальция и несвязанных биочернил.
8. Убедитесь, что каркас хранится в стерильной среде при температуре 4 °C, чтобы сохранить целостность и функциональность каркаса в течение трех месяцев.

5. Отслеживание выпуска электромобилей

1. Создание модели круговой кожной раны
   1. Обезболивание самцов гетерозиготных мышей с диабетом акита (8 недель) путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (70 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Подтвердите надлежащую анестезию, оценив отсутствие рефлекторных реакций (например, защемление пальца ноги) и контролируя частоту дыхания. Чтобы предотвратить сухость роговицы во время анестезии, наносите на глаза стерильную ветеринарную офтальмологическую мазь.
   2. Подготовьте участок кожи тыльной стороны, предварительно побрив его с помощью электрической машинки для стрижки. Избегайте раздражения кожи или травм. Простерилизовать выбритый участок с помощью раствора повидон-йода.
   3. С помощью стерильного захвата создайте круглую кожную рану толщиной 6 мм на тыльной поверхности каждой мыши.
   4. Аккуратно поместите напечатанный на 3D-принтере каркас с электромобилями с маркировкой PKH непосредственно на раневое ложе. Убедитесь, что каркас полностью покрывает раневую поверхность с минимальным количеством воздушных карманов, слегка надавливая стерильными щипцами. Убедитесь, что животное находится под пристальным наблюдением после процедуры и остается под присмотром до тех пор, пока оно полностью не придет в сознание и не сможет поддерживать лежачее положение за грудиной.
2. Флуоресцентная визуализация
   1. Через 2 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч после имплантации обезболить мышей изофлураном. Для индукции анестезии поместите мышей в камеру системы визуализации in vivo (IVIS) и подвергните их воздействию 2%-3% изофлурана в кислороде. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мышей, чтобы предотвратить сухость. После обезболивания переведите мышей в систему IVIS и поддерживайте их 1%-2% изофлураном в кислороде, доставляемым через носовые каналы. Убедитесь, что животные полностью обезболены и стабильны, прежде чем приступать к визуализации.
   2. Используйте систему IVIS для захвата флуоресцентных сигналов от электромобилей с маркировкой PKH, выпущенных из каркаса. В мастере визуализации выберите опцию «Флуоресцентная визуализация » и активируйте фильтры возбуждения и излучения для красителя PKH. Отрегулируйте параметры камеры, включая поле зрения и высоту объекта, для оптимизации обнаружения сигнала. Обеспечьте согласованное позиционирование во всех временных точках изображения для точного сравнения. Начните получать изображения и сохраняйте полученные данные.
   3. Количественное определение интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения IVIS. Это позволит отслеживать выпуск электромобилей с течением времени.

Высвобождение ВВ in vivo из каркасов Alg-EVs/CMCh и Alg-EVs/CMCh-AlgLyase показано на рисунке 1B, C. Как и ожидалось, каркас Alg-EVs/CMCh-AlgLyase продемонстрировал более быстрый профиль высвобождения по сравнению с Alg-EVs/CMCh, особенно в моменты времени 2 ч и 4 ч. Высвобожд?...

Ключевым аспектом протокола является конструкция каркаса «ядро-оболочка», которая имеет важное значение для достижения эффективной доставки электромобилей. Конструкция включает в себя Alg в качестве основного материала и комбинацию CMCh с Alglyase в качестве оболочки. Так...

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Особая благодарность Саиду Аль-Хашми и Абдулрахману Альмхарби из Happy Production за отличную работу в кино. Мы также выражаем благодарность Министерству высшего образования, исследований и инноваций и Университету Низвы за их финансовую поддержку и предоставление необходимых ресурсов.