Otimizando a entrega de vesículas extracelulares usando um andaime bioimpresso em 3D com bainha central para tratamento de feridas crônicas

Este estudo apresenta um protocolo para a fabricação de andaimes bioimpressos em 3D para cicatrização de feridas crônicas. As vesículas extracelulares são isoladas de células-tronco mesenquimais e carregadas no núcleo (alginato) com a bainha feita de carboximetilcelulose e alginato liase. Este projeto permite a degradação controlada do andaime e a liberação eficiente de EVs.

Este estudo descreve um protocolo detalhado para a fabricação de andaimes bioimpressos em 3D com bainha central projetados para melhorar a cicatrização de feridas crônicas. O protocolo envolve o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) de células-tronco mesenquimais (MSCs), conhecidas por suas propriedades regenerativas e imunomoduladoras. Esses EVs são então incorporados em uma estrutura de andaime exclusiva. O andaime apresenta um núcleo composto de alginato carregado com EVs, cercado por uma bainha feita de carboximetilcelulose e alginato liase. Este design inovador garante a degradação controlada do andaime, promovendo a liberação eficiente e controlada de EVs no local da ferida. O protocolo abrange as principais etapas, incluindo a preparação e caracterização dos EVs, a formulação de biotintas para bioimpressão 3D e a otimização dos parâmetros de impressão para alcançar a arquitetura de revestimento central desejada. Ao combinar integridade estrutural e bioatividade, o andaime visa abordar as limitações dos curativos convencionais, oferecendo uma abordagem direcionada para acelerar a regeneração do tecido e reduzir a inflamação em feridas crônicas. Este método fornece uma estratégia reprodutível e escalável para o desenvolvimento de biomateriais avançados com potenciais aplicações clínicas no tratamento de feridas crônicas. O protocolo também destaca considerações críticas para alcançar resultados consistentes, garantindo adaptabilidade para futuras aplicações terapêuticas.

Feridas crônicas, muitas vezes ligadas à inflamação excessiva, requerem tratamento oportuno para evitar complicações graves, como infecções e necrose tecidual, que podem levar a amputações. Apesar dos avanços, os tratamentos atuais permanecem caros, inconvenientes, com efeitos colaterais e eficácia limitada, destacando a necessidade de curativos mais curativos ^1,2,3. O desenvolvimento de uma nova geração de curativos projetados especificamente para feridas crônicas é essencial para enfrentar esses desafios. Além disso, a natureza complexa da cicatrização de feridas exige materiais de curativos com uma variedade de propriedades, incluindo hidratação, flexibilidade, adesão, bioatividade e biodegradabilidade⁴. Este estudo tem como objetivo desenvolver um curativo de bioengenharia que integre vesículas extracelulares (EVs) com um andaime bioimpresso em 3D para fornecer um ambiente terapêutico controlado e acelerar a cicatrização crônica de feridas.

As EVs derivadas de células-tronco auxiliam na cicatrização de feridas crônicas, promovendo respostas anti-inflamatórias, crescimento celular, migração e formação de vasos sanguíneos⁵. Além disso, os EVs podem fornecer moléculas bioativas, incluindo medicamentos de moléculas pequenas, construções de genes e proteínas para o tratamento de feridas crônicas⁶. Além disso, sua capacidade de proteger a carga da degradação enzimática melhora a estabilidade e a biodisponibilidade dos agentes terapêuticos, oferecendo vantagens distintas sobre os fatores de crescimento convencionais e os medicamentos de moléculas pequenas, que muitas vezes se degradam rapidamente in vivo⁷. Apesar dessas vantagens, a entrega eficiente e sustentada de EVs aos tecidos-alvo continua sendo um desafio significativo.

Os andaimes de bioimpressão 3D podem servir como uma plataforma de entrega para EVs para aumentar seus efeitos terapêuticos⁸. Esses andaimes imitam ambientes celulares naturais e permitem a liberação controlada de EVs ^9,10. Eles também protegem os EVs da degradação, aumentando a estabilidade de seus microRNAs e proteínas¹¹. Han et al. demonstraram que os EVs podem ser efetivamente liberados de andaimes GelMA bioimpressos em 3D. Essa liberação levou a uma melhor fixação celular e maior expressão gênica relacionada às vias de mecanotransdução em células-tronco mesenquimais da almofada de gordura bucal humana (hBFP-MSCs) semeadas nos andaimes¹². Born et al., otimizando a concentração do reticulador, alcançaram uma liberação controlada dos EVs. Essa abordagem demonstrou eficácia na promoção da angiogênese e oferece um método promissor para a entrega regulada de EVs¹³.

A bioimpressão 3D com bainha central permite a criação de estruturas complexas e multimateriais, imprimindo um material central envolto em uma bainha. O núcleo pode incluir células, fatores de crescimento ou drogas, enquanto a bainha oferece suporte mecânico e proteção ou atua como uma barreira. Este método tem aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, como o desenvolvimento de redes vasculares, imitação de estruturas de tecidos naturais e criação de sistemas de administração de medicamentos. Permite um controle preciso sobre a distribuição e composição do material, aumentando a funcionalidade e a relevância biológica dos construtos. Em comparação com técnicas alternativas, a bioimpressão 3D com bainha de núcleo fornece controle preciso sobre a distribuição e composição do material, melhorando a funcionalidade e a relevância biológica das construções^14,15.

A degradação projetada em curativos oferece benefícios como redução do desconforto durante as trocas, um ambiente úmido para cicatrização e controle de infecção, administração terapêutica oportuna e regeneração tecidual ideal 16,17,18. Os hidrogéis de alginato (Alg) e carboximetilcelulose (CMCh) são biocompatíveis e eficazes para fornecer vesículas extracelulares (EVs) a feridas, melhorando a cicatrização por meio da comunicação celular e redução da inflamação¹⁸. Neste estudo, os EVs foram integrados em um núcleo de Alg, enquanto uma bainha de CMCh e AlgLiase (AlgLiase) foi usada para permitir a rápida degradação do curativo e a entrega de EVs. Este design de bainha central facilita a liberação rápida de EVs em resposta à degradação do andaime, aumentando sua eficácia terapêutica e abordando as limitações dos tratamentos de feridas crônicas existentes. O objetivo principal deste estudo é desenvolver um curativo de bioengenharia que melhore a cicatrização de feridas, integrando a liberação controlada de EVs com um andaime degradável responsivo, melhorando os resultados do tratamento para feridas crônicas.

A pesquisa com animais foi conduzida em total conformidade com os padrões éticos estabelecidos pelo Comitê Nacional de Bioética e pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Nizwa. A aprovação ética para este estudo foi concedida sob autorização ID: VCGSR, AREC/01/2023. Todos os animais foram alojados em condições laboratoriais padrão, garantindo controles ambientais ideais, nutrição adequada e cuidados abrangentes para salvaguardar seu bem-estar durante todo o estudo. Todos os procedimentos envolvendo animais aderiram estritamente às políticas institucionais, aos padrões internacionais de cuidados com os animais e às diretrizes ARRIVE.

1. Cultura de células

1. Recupere um frasco de MSCs (passagem # 2) do armazenamento de nitrogênio líquido e manuseie-o com técnicas assépticas para evitar contaminação. Descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C, certificando-se de removê-las assim que restar um pequeno fragmento de gelo.
2. Prepare um meio completo, incluindo MSC SFM Basal Medium, suplementado com 1% (v/v) de suplemento MSC SFM XenoFree, 1% (v/v) de GlutaMAX e 0,01% (v/v) de gentamicina. Adicione 1 ml de meio completo pré-aquecido (37 °C) a uma taxa de 3 a 5 gotas de 5 em 5 segundos ao frasco para injetáveis e, em seguida, misture suavemente. Transfira todo o conteúdo do frasco para injetáveis de MSCs em um tubo cônico de 15 mL contendo 4 mL de meio completo pré-aquecido, sob condições assépticas em um gabinete de biossegurança Classe II.
3. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Certifique-se de que a centrífuga esteja balanceada adequadamente.
4. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio completo pré-aquecido. Em seguida, transfira as células para um frasco T25 contendo 4 mL de meio completo.
5. Incline suavemente o frasco para garantir que as células estejam uniformemente distribuídas. Incubar o balão a 37 °C com 5% de CO₂.
6. Troque o meio a cada 2 dias, substituindo-o por meio novo, pré-aquecido e completo. Use pipetagem suave para evitar a ruptura celular. Ao atingir 70%-80% de confluência, aspirar o meio gasto do balão T25.
7. Lave as células com 3 mL de PBS fresco para remover os resíduos. Assegurar uma cobertura completa do balão durante a lavagem.
8. Adicione 1 mL de solução de tripsina a 0,25% ao frasco T25, incube-o a 37 ° C por 3-7 min e monitore cuidadosamente o descolamento ao microscópio com aumento de 4x.
9. Bata suavemente no balão, se necessário, para garantir o desprendimento completo das células. Adicione meio completo pré-aquecido ao frasco e pipete para cima e para baixo sobre a superfície para ajudar a separar as células. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL.
10. Centrifugue o tubo a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Suspenda o pellet celular em um meio fresco e completo e conte as células usando um hemocitômetro Neubauer. Transferir as células para um balão T75. Garanta uma densidade de semeadura de 5.000 células/^cm2 para um crescimento ideal.
11. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂. Após 72 h de incubação celular, coletar o meio condicionado das células para isolamento de EVs. Use imediatamente após a coleta.

2. Isolamento de EVs

1. Centrifugue os 13 mL do meio condicionado coletado a 800 x g por 15 min para remover os detritos celulares. Filtrar o sobrenadante suavemente utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm para remover partículas grandes.
2. Adicione 5 mL de tampão de precipitação ao meio condicionado filtrado e vortex completamente para misturar. Certifique-se de que a solução seja homogênea.
3. Incubar a mistura durante a noite a 4 °C para permitir que os EVs precipitem. Centrifugar a mistura a 3.220 x g durante 30 min a 20 °C. Verifique o equilíbrio dos tubos.
4. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Centrifugue o pellet mais uma vez a 3.220 x g por 5 s para remover o líquido residual.
5. Pipete suavemente o pellet EV em 200 μL de PBS para evitar danos aos EVs. Meça a concentração de proteína EVs seguindo as instruções do fabricante (Kit de ensaio de proteína BCA).
6. Realize Western blotting para detectar marcadores específicos de EV (CD63, CD81 e CD9), para verificar o fenótipo^{EV 18}. A análise confirmou a presença desses marcadores, validando a identidade das VEs¹⁹.
7. Para minimizar o risco de contaminação por RNase, recomenda-se usá-lo diretamente sem armazenamento adicional. Caso seja necessário, armazene os EVs a -80 °C para uso posterior. Alicote a suspensão dos EVs em volumes de 40 μL para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

3. Rotulagem de EVs com PKH-26

1. Preparação do tampão
   1. Dissolva 0,238 g de HEPES em aproximadamente 90 mL de água ultrapura estéril em um recipiente estéril. Use uma solução HEPES recém-preparada. Adicione 0,85 g de NaCl à solução HEPES.
   2. Ajuste o pH para 7.4 usando 1 M NaOH ou HCl, conforme necessário, usando um medidor de pH calibrado. Adicione água deionizada para elevar o volume total para 100 mL. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm para a esterilizar.
2. Dilua 4 μL de corante PKH-26 em 1 mL de tampão preparado. Misture bem com pipeta para garantir a homogeneidade.
3. Ressuspenda EVs purificados em 1 mL de PBS a uma concentração de 700 μg / mL. Adicione 1 mL da suspensão EVs a 1 mL da solução PKH-26 preparada. Para o grupo de controle somente corante, adicione 1 mL de meio completo sem EVs a 1 mL da solução de PKH-26. Todas as etapas subsequentes são realizadas para o grupo de controle, bem como para levar em conta a possível agregação inespecífica ou formação de micelas.
4. Misture bem os EVs invertendo suavemente o tubo 10x-15x. Incube a mistura por 3-5 min em temperatura ambiente, garantindo uma exposição uniforme dos EVs ao corante.
5. Prepare uma solução fresca de 2 mL de BSA a 1% usando água ultrapura estéril e adicione-a aos 2 mL da mistura resultante para extinguir a reação de rotulagem. Misture delicadamente para evitar a agregação.
6. Concentre os EVs marcados com PKH-26 de acordo com o protocolo acima mencionado (etapas 2.2-2.7). Ressuspenda os EVs marcados em 300 μL de PBS. Pipete a amostra de EVs marcados com PKH-26 em um tubo de filtro de 30 kDa.
7. Centrifugar a amostra a 3.220 x g durante 30 min a 4 °C. Durante esta etapa, o corante PKH-26 livre e pequenas moléculas passarão pela membrana para o filtrado, enquanto os EVs marcados com PKH-26 serão retidos no retentado.
8. Após a centrifugação inicial, rejeitar o filtrado e adicionar 300 μl de PBS ao retentado. Ressuspenda suavemente os EVs no PBS pipetando para cima e para baixo.
9. Centrifugar novamente a amostra a 3.220 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar qualquer corante livre restante ou pequenas moléculas.
10. Confirmar a ausência de PKH-26 na solução filtrada por um microscópio fluorescente. Se algum corante for detectado, repita as etapas de lavagem.
11. Recolher a solução superior com uma micropipeta e retirar o filtro do tubo de recolha. Inverta cuidadosamente o filtro (vire-o de cabeça para baixo).
12. Centrifugue o filtro invertido a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Isso ajudará a coletar os PKH-26-EVs retidos da membrana do filtro para o novo tubo de coleta. Use diretamente os PKH-26-EVs para a próxima etapa.

4. 3D Bioimpressão

1. Preparação de biotintas
   1. Prepare uma solução fresca de Alg de sódio a 4,5% (p / v) usando água ultrapura estéril. Agitar durante a noite a 60 °C para permitir que a solução se dissolva completamente.
   2. Dissolva o CMCh em água ultrapura estéril para obter uma solução a 3,8% (p / v). Prepare fresco. Mexa durante a noite a 60 °C para dissolver completamente.
   3. Centrifugue as biotintas preparadas a 3.220 x g por 10 min a 25°C para remover quaisquer bolhas que possam interferir no processo de impressão.
   4. Misture os 3 mL preparados de solução de Alg com os EVs rotulados ou o controle somente de corante usando um misturador de seringa para atingir a concentração de 0,01% (p / v) de EVs. Garanta uma distribuição uniforme por meio de uma mistura suave.
   5. Usando um misturador de seringas, combine 1 mL de CMCh com uma solução de AlgLiase recém-preparada em água ultrapura estéril para atingir uma concentração final de 0,5 mU/mL.
2. Conforme ilustrado na Figura 1A, carregue simultaneamente a biotinta Alg/Exo na parte central e a biotinta CMCh/AlgLiase na parte da bainha da configuração da seringa núcleo/bainha.
3. Deixe as biotintas descansarem por 15 minutos antes de imprimir.
4. Configuração da impressora biológica 3D
   1. Usando o software de bioimpressora 3D, crie a estrutura do andaime selecionando uma forma cilíndrica com um padrão de preenchimento diagonal. Para isso, defina o diâmetro e a altura do cilindro para 20 mm e 1.1 mm, respectivamente. Configure o tamanho do poro para 1 mm.
   2. Defina as velocidades de bombeamento do núcleo e do bico da bainha para 1 mm/s com uma espessura de 0.25 mm por camada e defina a velocidade de movimento para 6 mm/s. Imprima quatro camadas com uma espessura de 0,25 mm por camada à temperatura ambiente.
5. Comece a imprimir em filme de poliéster.
6. Use o umidificador com cloreto de cálcio em aerossol (2.2%) para reticular o andaime durante o processo de extrusão. Posicione o bico do umidificador a aproximadamente 20 cm de distância do cabeçote de extrusão para garantir uma reticulação eficaz sem comprometer a estrutura do andaime. Para reticulação adicional, mergulhe o andaime em solução de cloreto de cálcio (2.2%) por 10 min.
7. Enxágue o andaime 3x com água ultrapura estéril para remover qualquer excesso de cloreto de cálcio e bioink não ligado.
8. Certifique-se de que o andaime seja armazenado em um ambiente estéril a 4 °C para manter a integridade e a funcionalidade do andaime por até três meses.

5. Rastreamento do lançamento de EVs

1. Criação de modelo de ferida cutânea circular
   1. Anestesie camundongos diabéticos heterozigotos Akita machos (8 semanas) administrando uma injeção intraperitoneal de cetamina (70 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confirme a anestesia adequada avaliando a ausência de respostas reflexas (por exemplo, pinça do dedo do pé) e monitore a frequência respiratória. Para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia, aplique pomada oftálmica veterinária estéril nos olhos.
   2. Prepare a área da pele dorsal raspando-a primeiro usando um aparador elétrico. Evite irritação ou lesões na pele. Esterilize a área depilada com uma solução de iodopovidona.
   3. Usando um aparador estéril, crie uma ferida cutânea circular de 6 mm de espessura total na superfície dorsal de cada camundongo.
   4. Coloque suavemente o andaime bioimpresso em 3D contendo EVs com etiqueta PKH diretamente no leito da ferida. Certifique-se de que o andaime cubra totalmente a superfície da ferida com bolsas de ar mínimas, pressionando levemente usando uma pinça estéril. Certifique-se de que o animal seja observado de perto após o procedimento e permaneça atendido até que recupere totalmente a consciência e possa manter a decúbito esternal.
2. Imagem fluorescente
   1. Às 2 h, 4 h, 8 h, 24 h pós-implantação, anestesiar os camundongos usando isoflurano. Para indução da anestesia, coloque os camundongos na câmara do sistema de imagem in vivo (IVIS) e exponha-os a 2%-3% de isoflurano em oxigênio. Aplique pomada oftálmica nos olhos dos camundongos para evitar o ressecamento. Uma vez anestesiados, transfira os camundongos para o sistema IVIS e mantenha-os com 1% -2% de isoflurano em oxigênio fornecido pelos canais nasais. Verifique se os animais estão totalmente anestesiados e estáveis antes de prosseguir com a imagem.
   2. Use o sistema IVIS para capturar os sinais fluorescentes dos EVs marcados com PKH liberados do andaime. No assistente de imagem, selecione a opção Imagem de fluorescência e ative os filtros de excitação e emissão para o corante PKH. Ajuste as configurações da câmera, incluindo o campo de visão e a altura do assunto, para otimizar a detecção do sinal. Garanta um posicionamento consistente em todos os pontos de tempo da imagem para permitir comparações precisas. Comece a adquirir imagens e salve os dados resultantes.
   3. Quantifique as intensidades do sinal fluorescente usando o software IVIS. Isso permitirá o rastreamento do lançamento de EVs ao longo do tempo.

A liberação in vivo de EVs dos andaimes Alg-EVs/CMCh e Alg-EVs/CMCh-AlgLiase é representada na Figura 1B,C. Como previsto, o andaime Alg-EVs/CMCh-AlgLiase exibiu um perfil de liberação mais rápida em comparação com Alg-EVs/CMCh, particularmente nos pontos de tempo de 2 h e 4 h. A liberação de EVs dos hidrogéis é governada por uma combinação de mecanismos físico-químicos, incluindo difusão, inchaço, erosão e degrad...

Um aspecto fundamental do protocolo é o projeto do andaime da bainha central, que é essencial para alcançar uma entrega eficiente de EVs. O design incorpora Alg como material principal e uma combinação de CMCh com Alglyase como bainha. Essa configuração facilita a liberação controlada e rápida de EVs. O material do núcleo, Alg, encapsula os EVs, garantindo sua proteção e entrega localizada. A bainha, composta por CMCh e Alglyase, permite a degradação acelerada do núcleo d...

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos especiais a Said Al-Hashmi e Abdulrahman Almharbi da Happy Production por seu excelente trabalho nas filmagens. Também estendemos nossa gratidão ao Ministério do Ensino Superior, Pesquisa e Inovação e à Universidade de Nizwa por seu apoio financeiro e por fornecer os recursos necessários.