Прямая контактная кокультура астроцитов и клеток глиобластомы, структурированных с использованием полиэлектролитных многослойных матриц

Этот протокол описывает структурированную прямую контактную кокультуру глиомы и астроцитов с использованием микроконтактной печати на полиэлектролитных мультислоях (ПЭМ) для моделирования клеток U87 или A172 GBM и первичных астроцитов.

Мультиформная глиобластома (ГБМ) является наиболее распространенным и смертельным злокачественным раком головного мозга. В 2020 и 2021 годах в Соединенных Штатах прогнозируется более 13 000 случаев заболевания. Опухоли ГБМ чаще всего возникают из астроцитов и характеризуются своей инвазивной природой, часто рекрутируя здоровые ткани в опухолевую ткань. Понимание связи между астроцитами и клетками глиобластомы жизненно важно для молекулярного понимания прогрессии опухоли. Этот протокол демонстрирует новый метод ко-культивирования для исследования контактно-опосредованных эффектов астроцитов на GBM с использованием послойной сборки и структурирования, управляемого микрокапиллярной силой. К преимуществам относятся среда без белков клеточных культур и точный контроль клеточного взаимодействия, продиктованный размерами паттерна. Этот метод обеспечивает универсальный, экономичный, воспроизводимый протокол для имитации клеточного взаимодействия между глиомой и астроцитами в опухолях глиомы. Эта модель может быть в дальнейшем использована для выявления изменений в молекулярной биологии GBM, вызванных физическим контактом с астроцитами или бесконтактной опосредованной коммуникацией растворимых кофакторов.

Мультиформная глиобластома (GBM) является самым распространенным и смертоносным раком мозга в Соединенных Штатах со средним временем выживаемости около 15^{месяцев.} Менее 7% пациентов с ГБМ выживают более 5 лет после постановки диагноза ^1,2. Через 10 лет этот показатель снизится до менее чем 1^%1,2. Несмотря на то, что в последние десятилетия выживаемость при других типах рака заметно улучшилась, успех пациентов с ГБМ недостаточен. Для разработки успешных терапевтических вмешательств необходимо использовать подходящую модель in situ для более глубокого понимания биологии опухоли GBM. Это понимание имеет решающее значение для улучшения клинических результатов у пациентов с ГБМ.

Мозг содержит большое разнообразие типов клеток, каждый из которых заполняет определенные ниши, способствуя функционированию и выживанию организма. Помимо нейронов, существуют различные глиальные клетки, включая астроциты, олигодендроциты и микроглию. Астроциты, в частности, участвуют в росте и инвазии опухоли ГБМ посредством секреции промигрирующих растворимых факторов³. Кроме того, есть некоторые сообщения о том, что физический контакт является движущей силой опосредованной астроцитами миграции и инвазии клеток глиомы ^4,5. Тем не менее, молекулярная основа, управляющая этим изменением, остается в значительной степени неизвестной.

Для изучения контактно-опосредованного влияния астроцитов на рост опухоли в этом протоколе сообщается о разработке воспроизводимого, безбелкового метода моделирования клеток in vitro. В этом методе полиэлектролитные многослойные слои (ПЭМ) систематически собираются для формирования однородной поверхности без белка. ПЭМ построены с использованием поликатион-полианионной системы, содержащей поли(диаллилметиламмония хлорид) (PDAC) и сульфированный поли(стерен) (SPS) соответственно. Эти полимеры были выбраны на основе предыдущих исследований, в которых сообщалось о преимущественном прикреплении клеток к SPS по сравнению с PDAC 6,7,8,9,10. На этих поверхностях ПЭМ в этом протоколе используется микрокапиллярно-силовая литография для создания структурированных моделей сокультур первичных астроцитов и клеток GBM.

Представленные здесь методы позволяют точно проектировать специфические межклеточные взаимодействия путем управления структурой поверхности, тем самым поддерживая высоковоспроизводимое исследование клеточной коммуникации. Кроме того, биомиметическая поверхность, присущая этой платформе, облегчает изучение прямой межклеточной коммуникации, что имеет решающее значение для углубления механистического понимания коммуникации между различными типами клеток. Помимо этого, метод является недорогим, что дает значительное преимущество при проведении исследований in vitro для изучения клеточной связи. В частности, этот протокол использует дифференциальное присоединение GBM к SPS (-) через PDAC (+) для создания структурированных кокультур клеточных линий GBM и первичных астроцитов.

Данное исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Небраски-Линкольна (ID проекта: 1046). Первичные астроциты получали из 1-3-дневных детенышей крыс Sprague-Dawley в соответствии с протоколом IACUC 1046 UNL и по протоколу с незначительными изменениями ^7,11.

1. Подготовка

1. Получите мастер-шаблон желаемой геометрии перед началом работы с этим протоколом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются коммерчески доступные кремниевые пластины, изготовленные с использованием стандартных методов фотолитографии. Рекомендуемая начальная схема – 100-200 мкм линий.
2. Подготовьте буферы и среды.
   1. Приготовьте полимерные растворы поли(диаллилметиламмония) (PDAC) и сульфированного поли(стерена) (SPS) для покрытия пластин.
      1. Раствор покрытия PDAC содержит 0,3 мас.% PDAC и 0,1 М NaCl в ddH₂O.
      2. Раствор покрытия SPS составляет 30 мкМ SPS и 0,1 М NaCl в ddH₂O.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 1 л раствора для нанесения покрытия PDAC и 1 л раствора для нанесения покрытия SPS достаточно для покрытия шести 6-луночных планшетов. Растворы можно использовать повторно 2-5 раз. Заменяйте растворы, когда они становятся мутными.
   2. При необходимости приготовьте стандартные среды для клеточных культур.
      1. Типичными астроцитарными средами и средой для ГБМ являются, соответственно, 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM).
3. Получение, подготовка или размораживание клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описан для первичных астроцитов крыс, выделенных из неонатальных крыс на 1-3 день и клеток глиомы U87MG или A172-MG. Этот протокол может быть расширен на аналогичные клеточные линии после подтверждения дифференциального прикрепления представляющих интерес клеточных линий на полимерных поверхностях.
   1. Из-за потери клеток во время окрашивания используйте минимум 200 000 клеток GBM в день 0 и 400 000 живых первичных астроцитов крыс в день 1 на лунку в 6-луночном планшете. Отрегулируйте номера ячеек, если используете лунку или пластину другого размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные астроциты из пассажей 2-4, подготовленные в соответствии с описанием Wilson и соавторов¹², рекомендуются для данного протокола. Клетки глиомы были получены коммерчески (см. Таблицу материалов).

2. Литье штампов на основе полидиметилсилоксана (PDMS)

1. В одноразовом контейнере взвесьте 12 весовых частей (по весу) предварительного полимера PDMS и 1 весовую часть отвердителя. Энергично перемешивайте в течение 2-4 минут, пока вся смесь не заполнится пузырьками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 26 г смеси достаточно для одной чашки Петри диаметром 100 мм.
2. Поместите фторсилан в фторсилановый эксикатор. Поместите одноразовую емкость с полимерной смесью в эксикатор для дегазации на 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет пузырькам подниматься из смеси. Может потребоваться больше времени, если через 20 минут крупные пузырьки все еще присутствуют.
3. Поместите предварительно структурированную структуру мастера в чашку Петри. Медленно вылейте смесь PDMS в чашку Петри на предварительно структурированную структуру, убедившись, что она полностью покрывает мастер. Оптимальная глубина слоя PDMS составляет около 2-3 мм толщиной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха, медленно выливая смесь. Убедитесь, что силиконовый мастер лежит ровно в чашке Петри.
4. Держите чашку Петри в фторсилановом эксикаторе до тех пор, пока не будут удалены все пузырьки. Чашку Петри выдержать в духовке при температуре 60 °C в течение 1 часа. Если температура 60 °C недоступна, высушите чашку Петри при 37 °C в течение ночи.
5. С помощью острого скальпеля равномерно и аккуратно разрежьте вокруг мастера.
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при использовании скальпеля. Никогда не оставляйте открытое лезвие без присмотра. Скальпели острые. Используйте соответствующие меры предосторожности для предотвращения травм.
6. Удалите штамп с помощью пинцета и положите его на режущую поверхность, например на разделочную доску. С помощью скальпеля разрежьте штампы до размера, достаточно мелкого, чтобы поместиться в 6-луночные пластины (примерно 2,5 см х 2,5 см).

3. Строительные полиэлектролитные мультислои (ПЭМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе описывается нанесение плазменного покрытия с помощью прилагаемого баллона с кислородом под давлением и приспособления для смешивания газа (см. Таблицу материалов). Подходит любой метод равномерной плазменной очистки поверхности тканевой культуры полистиролом (ТКС). При использовании другого метода плазменной очистки пользователю может потребоваться оптимизировать время и интенсивность.

1. Плазменная очистка 6-луночного планшета в течение 7 мин.
   1. Прокачайте камеру, поворачивая трехходовой клапан на передней части двери вправо до тех пор, пока не будет слышно шипение от выпуска воздуха. Поверните трехходовой клапан обратно в вертикальное положение, когда показания давления превысят 1800 м° рт. ст.
   2. Откройте дверцу и поставьте 6-луночную пластину в камеру. Закройте дверцу и включите вакуумный насос. Откачайте камеру до тех пор, пока давление не станет стабильным на уровне около 100 мторр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время вакуумирования камеры убедитесь, что кислородный бак открыт, а выходное давление кислорода составляет 10 фунтов на квадратный дюйм.
   3. Откройте трехходовой клапан влево, чтобы выровнять линию с шлангом подачи кислорода. Дайте газообразному кислороду просочиться в камеру до тех пор, пока давление не стабилизируется между 400 и 450 мторр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что входное давление на расходомере составляет 10 мм, и при необходимости отрегулируйте.
   4. Включите радиочастотное питание. Дождитесь формирования плазмы (~15 с), а затем запустите таймер на 7 мин.
   5. Через 7 минут выключите радиочастотное питание и верните трехходовой клапан в вертикальное положение. Дайте камере откачаться до 150 мТорр.
   6. Выключите вакуумный насос и подождите, когда давление поднимется до 1500 мТорр. Проветрите камеру, поворачивая трехходовой клапан вправо до тех пор, пока не будет слышно шипение от выпуска воздуха. Когда показания давления превысят 1800 мТорр, поверните трехходовой клапан обратно в вертикальное положение, откройте дверцу и извлеките образец.
2. Поместите пластины с плазменным покрытием в ванны комнатной температуры следующим образом: PDAC на 20 минут, DI-вода на 5 мин, DI-вода на 5 мин, SPS на 20 мин, DI-вода на 5 мин и DI-вода на 5 мин. Убедитесь, что вся поверхность пластины погружена в воду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально можно использовать автоматическую морилку для слайдов для сокращения времени активности. Используйте осторожное перемешивание, если это возможно.
3. Повторите предыдущий шаг в общей сложности 10 раз. Дайте пластинам высохнуть на воздухе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные пластины можно хранить при комнатной температуре до нескольких недель перед использованием.

4. Структурирование ПЭМ с помощью микроформования в капиллярах

1. Промойте штампы PDMS мягким лабораторным мылом, а затем проведите его деионизированной водой. Высушите штампы с помощью воздушного компрессора и поместите их на плоскую подвижную поверхность, например, на неиспользуемую крышку 6-луночной пластины.
   ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Штампы также можно сушить на воздухе. Марки должны быть закрыты и защищены от пыли во время сушки.
2. Нанесите плазменное покрытие на штампы, как описано в шаге 3, в течение 1 минуты. Своевременно удалите штампы из плазмоочистителя и положите их лицевой стороной вниз на подготовленные 6-луночные планшеты.
3. Пипеткой нанесите 10 мкл раствора PDAC по нижнему краю штампа, равномерно распределяя полимер по длине штампа. Обязательно добавьте полимер на сторону штампа с отверстиями из линейных узоров, чтобы обеспечить капиллярное действие.
4. Поместите груз весом 350 г поверх каждого штампа на 20 секунд, чтобы усилить узор. Дайте штампам отдохнуть на пластинах в течение 20 минут.
5. Опустите пластину в воду DI и снимите штампы в направлении линий узоров. Вымойте тарелку дважды по 5 минут в деионизированной воде.
6. Промойте штампы с мылом и деионизированной водой и высушите с помощью воздушного компрессора. Дайте пластине высохнуть на воздухе.
7. Если планшеты готовы к культивированию клеток, простерилизуйте их под воздействием ультрафиолетового излучения в колпаке класса II в течение не менее 8 часов непосредственно перед использованием. Минимальная рекомендуемая общая доза УФ-С составляет 400 мДж/^см2 при 265 нм. Если вы визуализируете узоры, пропустите этап УФ-стерилизации и выполните шаг 5. Если вы готовы к культивированию клеток, выполните шаг 6 после УФ-стерилизации.

5. Визуализация штампованных узоров с карбоксифлуоресцеином (CFSE)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эту процедуру, чтобы визуализировать штампованные узоры, или пропустите этот шаг и вместо этого подготовьте шаблоны для клеточной культуры. После окрашивания узоров их нельзя использовать для культивирования клеток. Как только будет достигнута достаточная уверенность в штамповке, образцы можно использовать для культивирования клеток. Карбоксифлуоресцеин светочувствительный. Окрашивать и транспортировать в темное время суток.

1. Поместите высушенные штампованные узоры в раствор для окрашивания рисунка CFSE (0,1 μМ CFSE в 0,1 М NaOH) на 60-90 минут. Вымыть штампованные шаблоны в течение 5 мин в DI H₂O два раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете предметные стекла, поместите все предметное стекло в пробирку объемом 50 мл с раствором для окрашивания. Если вы используете хорошо расположенные пластины, добавьте достаточно раствора для окрашивания, чтобы покрыть весь рисунок.
2. Визуализируйте узоры с помощью подходящего флуоресцентного микроскопа.
   1. Включите люминесцентную лампу, чтобы она нагрелась в течение 10 минут. Поскольку шаблоны окрашиваются с помощью CFSE, используйте интерференционный синий фильтр (IB) для визуализации зеленых узоров. Просматривайте выкройки и делайте фотографии.

6. Окрашивание и посев клеток глиобластомы карбоксифлуоресцеином

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами должны выполняться в подходящем шкафу биобезопасности класса II.

1. Отделите клетки от поверхности культуры с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА, центрифугируйте при 200 x g в течение 4 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
2. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды для клеточных культур без сыворотки (DMEM и 1% пенициллин-стрептомицин), центрифугируйте при 200 x g в течение 4 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
3. Ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS и перенесите в стерильную 1,5 мл пробирку. Добавьте 10 мкл 10 мкг/мл CFSE и сразу же тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут и переложить в стерильную пробирку объемом 15 мл.
4. Добавьте минимум 1 мл среды для культивирования клеток (см. шаг 1.2.2.1) для гашения реакции красителя CFSE. Центрифугируйте при 400 x g в течение 10 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 5 мл среды для культивирования клеток и переложите в свежую стерильную пробирку объемом 15 мл.
5. Центрифугируйте при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 5 мл среды для культивирования клеток.
6. Повторите предыдущий этап стирки дважды.
7. Засейте окрашенные клетки глиомы (100 клеток/^мм2 или 100 000 клеток/лунку) в структурированный 6-луночный планшет для культивирования тканей из этапа 4 с питательной средой для астроцитов. Культивируйте клетки в инкубаторе (37 °C, 5%_CO2) в течение 24 ч перед добавлением окрашенных астроцитов на этапе 7.

7. Окрашивание и посев первичных астроцитов PKH26

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы по культивированию клеток должны выполняться в подходящем шкафу биобезопасности класса II.

1. Отделите клетки от поверхности культуры с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА, центрифугируйте при 200 x g в течение 4 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
2. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды для клеточных культур без сыворотки (DMEM и 1% пенициллин-стрептомицин), центрифугируйте при 200 x g в течение 4 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость.
3. Приготовьте 2x клеточную суспензию, повторно суспендировав клеточную гранулу в 0,5 мл разбавителя C комнатной температуры из набора PKH26.
4. Приготовьте 2x раствор красителя (4 x ^10-6 M), добавив 2 мкл PKH26 к 0,5 мл разбавителя C в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Приготовьте раствор красителя непосредственно перед использованием.
5. Добавьте 2x клеточную суспензию в 2x раствор красителя и немедленно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
6. Инкубируйте клеточную суспензию в течение 1-5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание происходит быстро, а разбавитель С вреден для клеток. Более длительная инкубация не означает лучшего окрашивания.
7. Угасите окрашивание, добавив минимум в 5 раз объем среды для клеточных культур и инкубируя в течение 1 минуты для связывания излишков красителя.
8. Центрифугируйте при 200 х г в течение 10 мин при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 5 мл клеточной питательной среды и переложите в новую стерильную пробирку объемом 15 мл.
9. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 5 мл PBS.
10. Центрифугировать при 200 х г в течение 5 мин при 4 °С, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать в 5 мл среды для клеточных культур.
11. Повторите шаги 7.9 и 7.10 в общей сложности три стирки.
12. Засейте окрашенные астроциты (200 клеток/^мм2 или 200 000 клеток/лунку) астроцитарными средами (см. шаг 1.2.2.1) в структурированном 6-луночном планшете для культуры тканей, предварительно засеянном клетками глиомы из этапа 6. Культивируют клетки в инкубаторе с температурой 37 °С, 5%_СО2 на время проведения экспериментов.

8. Флуоресцентная визуализация структурированной монокультуры и кокультуры

1. Включите люминесцентную лампу, чтобы она нагрелась в течение 10 минут.
2. Извлеките культуру клеток из инкубатора и установите ее на предметный столик инвертированного микроскопа, способного проводить флуоресцентную визуализацию.
3. Вставьте или прикрепите соответствующий фильтр. Если визуализируемые клетки окрашены с помощью CFSE, используйте интерференционный синий фильтр (IB) для визуализации зеленых клеток. Если визуализируемые клетки окрашены PKH26, используйте фильтр Родамина для визуализации эритроцитов.
4. Посмотрите образец и сделайте фотографии.
   Примечание: Теперь клетки могут быть разделены с помощью проточной цитометрии для анализа биологических эффектов контактно-опосредованной коммуникации.

В приведенном здесь протоколе описывается инженерия прямого контакта с шаблонной кокультурой клеток глиомы и астроцитов. Эта платформа представляет собой биомиметическую многоклеточную модель для изучения роли прямого контакта в коммуникации между астроцитами и ?...

Важнейшие шаги для обеспечения успешной сборки воспроизводимой структурированной кокультуры включают: 1) успешное моделирование поверхности путем микроформования в капиллярах, 2) успешную промывку окрашенных клеток и 3) анализ кокультуры в окне «зрелой культуры». Во...

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа была поддержана, полностью или частично, грантами NIH 1R01AA027189-01A1 (С.К.), P20 GM104320 (пилотному гранту Центра по профилактике ожирения Небраски для С.К.), P20 GM113126 (Центру интегрированной биомолекулярной коммуникации Небраски - руководитель проекта С.К.); Грант Управления исследований и разработок UNL Biomedical Seed Grant и грант Nebraska Research Initiative-Systems Grant (для S.K.). K.M.S. финансировался через T32GM107001, грант на обучение.