Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Этот протокол описывает структурированную прямую контактную кокультуру глиомы и астроцитов с использованием микроконтактной печати на полиэлектролитных мультислоях (ПЭМ) для моделирования клеток U87 или A172 GBM и первичных астроцитов.
Мультиформная глиобластома (ГБМ) является наиболее распространенным и смертельным злокачественным раком головного мозга. В 2020 и 2021 годах в Соединенных Штатах прогнозируется более 13 000 случаев заболевания. Опухоли ГБМ чаще всего возникают из астроцитов и характеризуются своей инвазивной природой, часто рекрутируя здоровые ткани в опухолевую ткань. Понимание связи между астроцитами и клетками глиобластомы жизненно важно для молекулярного понимания прогрессии опухоли. Этот протокол демонстрирует новый метод ко-культивирования для исследования контактно-опосредованных эффектов астроцитов на GBM с использованием послойной сборки и структурирования, управляемого микрокапиллярной силой. К преимуществам относятся среда без белков клеточных культур и точный контроль клеточного взаимодействия, продиктованный размерами паттерна. Этот метод обеспечивает универсальный, экономичный, воспроизводимый протокол для имитации клеточного взаимодействия между глиомой и астроцитами в опухолях глиомы. Эта модель может быть в дальнейшем использована для выявления изменений в молекулярной биологии GBM, вызванных физическим контактом с астроцитами или бесконтактной опосредованной коммуникацией растворимых кофакторов.
Мультиформная глиобластома (GBM) является самым распространенным и смертоносным раком мозга в Соединенных Штатах со средним временем выживаемости около 15месяцев. Менее 7% пациентов с ГБМ выживают более 5 лет после постановки диагноза 1,2. Через 10 лет этот показатель снизится до менее чем 1%1,2. Несмотря на то, что в последние десятилетия выживаемость при других типах рака заметно улучшилась, успех пациентов с ГБМ недостаточен. Для разработки успешных терапевтических вмешательств необходимо использовать подходящую модель in situ для более глубокого понимания биологии опухоли GBM. Это понимание имеет решающее значение для улучшения клинических результатов у пациентов с ГБМ.
Мозг содержит большое разнообразие типов клеток, каждый из которых заполняет определенные ниши, способствуя функционированию и выживанию организма. Помимо нейронов, существуют различные глиальные клетки, включая астроциты, олигодендроциты и микроглию. Астроциты, в частности, участвуют в росте и инвазии опухоли ГБМ посредством секреции промигрирующих растворимых факторов3. Кроме того, есть некоторые сообщения о том, что физический контакт является движущей силой опосредованной астроцитами миграции и инвазии клеток глиомы 4,5. Тем не менее, молекулярная основа, управляющая этим изменением, остается в значительной степени неизвестной.
Для изучения контактно-опосредованного влияния астроцитов на рост опухоли в этом протоколе сообщается о разработке воспроизводимого, безбелкового метода моделирования клеток in vitro. В этом методе полиэлектролитные многослойные слои (ПЭМ) систематически собираются для формирования однородной поверхности без белка. ПЭМ построены с использованием поликатион-полианионной системы, содержащей поли(диаллилметиламмония хлорид) (PDAC) и сульфированный поли(стерен) (SPS) соответственно. Эти полимеры были выбраны на основе предыдущих исследований, в которых сообщалось о преимущественном прикреплении клеток к SPS по сравнению с PDAC 6,7,8,9,10. На этих поверхностях ПЭМ в этом протоколе используется микрокапиллярно-силовая литография для создания структурированных моделей сокультур первичных астроцитов и клеток GBM.
Представленные здесь методы позволяют точно проектировать специфические межклеточные взаимодействия путем управления структурой поверхности, тем самым поддерживая высоковоспроизводимое исследование клеточной коммуникации. Кроме того, биомиметическая поверхность, присущая этой платформе, облегчает изучение прямой межклеточной коммуникации, что имеет решающее значение для углубления механистического понимания коммуникации между различными типами клеток. Помимо этого, метод является недорогим, что дает значительное преимущество при проведении исследований in vitro для изучения клеточной связи. В частности, этот протокол использует дифференциальное присоединение GBM к SPS (-) через PDAC (+) для создания структурированных кокультур клеточных линий GBM и первичных астроцитов.
Данное исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Небраски-Линкольна (ID проекта: 1046). Первичные астроциты получали из 1-3-дневных детенышей крыс Sprague-Dawley в соответствии с протоколом IACUC 1046 UNL и по протоколу с незначительными изменениями 7,11.
1. Подготовка
2. Литье штампов на основе полидиметилсилоксана (PDMS)
3. Строительные полиэлектролитные мультислои (ПЭМ)
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе описывается нанесение плазменного покрытия с помощью прилагаемого баллона с кислородом под давлением и приспособления для смешивания газа (см. Таблицу материалов). Подходит любой метод равномерной плазменной очистки поверхности тканевой культуры полистиролом (ТКС). При использовании другого метода плазменной очистки пользователю может потребоваться оптимизировать время и интенсивность.
4. Структурирование ПЭМ с помощью микроформования в капиллярах
5. Визуализация штампованных узоров с карбоксифлуоресцеином (CFSE)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эту процедуру, чтобы визуализировать штампованные узоры, или пропустите этот шаг и вместо этого подготовьте шаблоны для клеточной культуры. После окрашивания узоров их нельзя использовать для культивирования клеток. Как только будет достигнута достаточная уверенность в штамповке, образцы можно использовать для культивирования клеток. Карбоксифлуоресцеин светочувствительный. Окрашивать и транспортировать в темное время суток.
6. Окрашивание и посев клеток глиобластомы карбоксифлуоресцеином
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами должны выполняться в подходящем шкафу биобезопасности класса II.
7. Окрашивание и посев первичных астроцитов PKH26
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы по культивированию клеток должны выполняться в подходящем шкафу биобезопасности класса II.
8. Флуоресцентная визуализация структурированной монокультуры и кокультуры
В приведенном здесь протоколе описывается инженерия прямого контакта с шаблонной кокультурой клеток глиомы и астроцитов. Эта платформа представляет собой биомиметическую многоклеточную модель для изучения роли прямого контакта в коммуникации между астроцитами и ?...
Важнейшие шаги для обеспечения успешной сборки воспроизводимой структурированной кокультуры включают: 1) успешное моделирование поверхности путем микроформования в капиллярах, 2) успешную промывку окрашенных клеток и 3) анализ кокультуры в окне «зрелой культуры». Во...
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана, полностью или частично, грантами NIH 1R01AA027189-01A1 (С.К.), P20 GM104320 (пилотному гранту Центра по профилактике ожирения Небраски для С.К.), P20 GM113126 (Центру интегрированной биомолекулярной коммуникации Небраски - руководитель проекта С.К.); Грант Управления исследований и разработок UNL Biomedical Seed Grant и грант Nebraska Research Initiative-Systems Grant (для S.K.). K.M.S. финансировался через T32GM107001, грант на обучение.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200056 | |
15 ml Nunc Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester | Millipore Sigma | Cat#21888 | |
50 ml Nunc Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
A172-MG GBM cell line | ATCC | CRL-1620 | |
Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629 | Or other suitable cell counting device |
Cell Incubator | N/A | N/A | |
Cooled tabletop centrifuge for 15 mL tubes | N/A | N/A | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | MP Biomedicals | ICN 1033120 | |
Expanded Plasma Cleaner | Plasma Harrick | PDC-001-HP | With attached pressurized oxygen tank and PlasmaFlo Gas Mixer (PDC-FMG) accessory |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550H | |
Fluorosilane | Sigma Aldrich | 667420 | Full chemical name: 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane |
Inverted Tabletop Microscope | N/A | N/A | Microscope capable of fluorescent imaging with λex = 551 nm; λem 567 nm [e.g. Rhodamine filter] (PKH26 dye) and λex 492 nm; λem 517 nm [e.g. interference blue filter (IB)] (CFSE dye) |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
NaOH | Sigma Aldrich | 567530 | |
Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Millipore Sigma | Cat#MINI26-1KT | |
Poly(diallyldimethylammonium chloride) solution (PDAC) | Sigma Aldrich | 409014 | 20 wt. % in H2O |
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (SPS) | Sigma Aldrich | 243051 | average MW ~70,000 |
Primary Astrocytes, isolated from Srague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | Rats from Charles River; Lab isolated Cells |
Scalpel | N/A | N/A | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical | Cat#2646340 | |
Trypan Blue Stain | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
TryplE | Fisher Scientific | Gibco TrypLE | |
U87-MG GBM cell line | ATCC | HTB-14 | |
Vacuum Desiccator | N/A | N/A |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены