Co-culture par contact direct d’astrocytes et de cellules de glioblastome modélisée à l’aide de modèles multicouches de polyélectrolytes

Ce protocole décrit une co-culture de gliomes et d’astrocytes par contact direct utilisant l’impression par micro-contact sur des multicouches de polyélectrolytes (PEM) pour modéliser des cellules GBM U87 ou A172 et des astrocytes primaires.

Le glioblastome multiforme (GBM) est le cancer du cerveau malin le plus abondant et le plus mortel. Plus de 13 000 cas sont prévus aux États-Unis en 2020 et 2021. Les tumeurs GBM proviennent le plus souvent d’astrocytes et se caractérisent par leur nature invasive, recrutant souvent des tissus sains dans le tissu tumoral. La compréhension de la communication entre les astrocytes et les cellules de glioblastome est essentielle pour la compréhension moléculaire de la progression tumorale. Ce protocole fait la démonstration d’une nouvelle méthode de co-culture structurée pour étudier les effets médiés par contact des astrocytes sur le GBM en utilisant l’assemblage couche par couche et la structuration par micro-capillarité. Les avantages comprennent un environnement de culture cellulaire sans protéines et un contrôle précis de l’interaction cellulaire dicté par les dimensions du motif. Cette technique fournit un protocole polyvalent, économique et reproductible pour imiter l’interaction cellulaire entre le gliome et les astrocytes dans les tumeurs de gliome. Ce modèle peut également être utilisé pour démêler les changements dans la biologie moléculaire du GBM dus au contact physique avec les astrocytes ou à la communication de cofacteurs solubles sans contact.

Le glioblastome multiforme (GBM) est le cancer du cerveau le plus prolifique et le plus mortel aux États-Unis, avec une durée de survie médiane d’environ 15^mois1. Moins de 7 % des patients atteints de GBM survivent plus de 5 ans après le diagnostic ^1,2. Au bout de 10 ans, ce chiffre tombe à moins de 1 %^1,2. Bien que d’autres types de cancer aient considérablement amélioré la survie au cours des dernières décennies, le succès des patients atteints de GBM est insuffisant. Pour développer des interventions thérapeutiques réussies, un modèle in situ approprié doit être utilisé pour développer une compréhension plus approfondie de la biologie tumorale du GBM. Cette compréhension est cruciale pour améliorer les résultats cliniques des patients atteints de GBM.

Le cerveau contient une grande variété de types de cellules, chacune remplissant des niches spécifiques pour favoriser le fonctionnement et la survie de l’organisme. En plus des neurones, il existe une variété de cellules gliales, notamment des astrocytes, des oligodendrocytes et des microglies. Les astrocytes, en particulier, ont été impliqués dans la croissance et l’invasion des tumeurs GBM par la sécrétion de facteurs solubles pro-migratoires³. De plus, certains rapports indiquent que le contact physique est la force motrice de la migration et de l’invasion des cellules de gliome médiées par les astrocytes ^4,5. Cependant, la base moléculaire à l’origine de ce changement reste largement inconnue.

Afin d’étudier les effets médiés par contact des astrocytes sur la croissance tumorale, ce protocole rend compte du développement d’une méthode reproductible et sans protéines pour la structuration cellulaire in vitro. Dans cette méthode, les multicouches de polyélectrolytes (PEM) sont systématiquement assemblées pour former une surface uniforme sans protéines. Les PEM sont construits à l’aide d’un système polycation-polyanion comprenant respectivement du poly(chlorure de diallylméthylammonium) (PDAC) et du poly(styrène) sulfoné (SPS). Ces polymères ont été choisis sur la base d’études antérieures qui ont rapporté une fixation préférentielle des cellules au SPS par rapport au PDAC 6,7,8,9,10. Sur ces surfaces PEM, ce protocole utilise la lithographie à force microcapillaire pour concevoir des modèles de co-culture structurés d’astrocytes primaires et de cellules GBM.

Les techniques présentées ici permettent l’ingénierie précise d’interactions cellule-cellule spécifiques grâce au contrôle de la structuration de surface, soutenant ainsi l’étude hautement reproductible de la communication cellulaire. De plus, la surface biomimétique inhérente à cette plateforme facilite l’étude de la communication directe entre les cellules, ce qui est crucial pour approfondir la compréhension mécaniste de la communication entre différents types de cellules. Au-delà de cela, la méthode est peu coûteuse, ce qui offre un avantage significatif pour mener des études in vitro afin d’explorer la communication cellulaire. Plus précisément, ce protocole exploite la fixation différentielle du GBM sur SPS (-) sur le PDAC (+) pour créer des co-cultures structurées de lignées cellulaires de GBM et d’astrocytes primaires.

Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université du Nebraska-Lincoln (ID de projet : 1046). Les astrocytes primaires ont été préparés à partir de rateaux Sprague-Dawley âgés de 1 à 3 jours, conformément au protocole IACUC 1046 de l’UNL et selon le protocole avec de légères modifications ^7,11.

1. Préparatifs

1. Obtenez un modèle maître de la géométrie souhaitée avant de commencer ce protocole.
   REMARQUE : Des plaquettes de silicium disponibles dans le commerce et préparées à l’aide de techniques de photolithographie standard sont utilisées dans ce protocole. Le modèle de départ recommandé est de 100 à 200 μm de lignes.
2. Préparez les tampons et les supports.
   1. Préparez des solutions de polymère de poly(diallylméthylammonium) (PDAC) et de poly(styrène) sulfoné (SPS) pour enrober les plaques.
      1. La solution de revêtement PDAC est de 0,3 % en poids de PDAC et de 0,1 M de NaCl dans jjdH₂O.
      2. La solution de revêtement SPS est de 30 μM SPS et 0,1 M de NaCl dans ddH₂O.
         REMARQUE : 1 L de solution d’enrobage PDAC et 1 L de solution d’enrobage SPS suffisent pour enrober six plaques à 6 puits. Les solutions peuvent être réutilisées 2 à 5 fois. Remplacez les solutions lorsqu’elles deviennent troubles.
   2. Préparez des milieux de culture cellulaire standard, si nécessaire.
      1. Les milieux astrocytaires et GBM typiques sont, respectivement, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
3. Obtenir, préparer ou décongeler des cellules.
   REMARQUE : Ce protocole est décrit pour les astrocytes primaires de rat isolés à partir de rats nouveau-nés de 1 à 3 jours et de cellules de gliome U87MG ou A172-MG. Ce protocole peut être étendu à des lignées cellulaires similaires après confirmation de l’attachement différentiel de lignées cellulaires d’intérêt sur les surfaces des polymères.
   1. En raison de la perte de cellules pendant la coloration, utilisez un minimum de 200 000 cellules GBM le jour 0 et 400 000 astrocytes primaires de rat vivants le jour 1 par puits dans une plaque à 6 puits. Ajustez les numéros de cellule si vous utilisez un puits ou une plaque de taille différente.
      REMARQUE : Les astrocytes primaires des passages 2 à 4 préparés comme décrit par Wilson et ses collègues¹² sont recommandés pour ce protocole. Les cellules de gliome ont été obtenues commercialement (voir la table des matériaux).

2. Moulage de tampon de polydiméthylsiloxane (PDMS)

1. Dans un récipient jetable, peser 12 parties (en poids) de prépolymère PDMS et 1 partie (en poids) d’agent de durcissement. Mélangez vigoureusement pendant 2 à 4 minutes jusqu’à ce que tout le mélange soit rempli de bulles.
   REMARQUE : 26 g du mélange suffisent pour une boîte de Pétri de 100 mm.
2. Placez le fluorosilane dans le dessiccateur de fluorosilane. Placez le récipient jetable avec le mélange de polymères dans le dessiccateur pour dégazer pendant 20 min.
   REMARQUE : Cela permet aux bulles de sortir du mélange. Plus de temps peut être nécessaire si de grosses bulles sont toujours présentes après 20 min.
3. Placez le maître de structure pré-structuré dans une boîte de Pétri. Versez lentement le mélange PDMS dans la boîte de Pétri sur le maître de structure pré-motif, en veillant à couvrir complètement le maître. La profondeur optimale de la couche PDMS est d’environ 2 à 3 mm d’épaisseur.
   REMARQUE : Évitez de créer des bulles d’air en versant lentement le mélange. Assurez-vous que le master en silicone est à plat dans la boîte de Pétri.
4. Conservez la boîte de Pétri dans le dessiccateur au fluorosilane jusqu’à ce que toutes les bulles soient éliminées. Faites durcir la boîte de Pétri dans un four à 60 °C pendant 1 h. Si 60 °C n’est pas disponible, faites durcir la boîte de Pétri à 37 °C pendant la nuit.
5. À l’aide d’un scalpel bien aiguisé, coupez uniformément et doucement autour du maître.
   ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous utilisez un scalpel. Ne laissez jamais la lame exposée sans surveillance. Les scalpels sont tranchants. Prenez des précautions de sécurité appropriées pour éviter les blessures.
6. Retirez le tampon à l’aide d’une pince à épiler et placez-le sur une surface de coupe telle qu’une planche à découper. À l’aide d’un scalpel, découpez les tampons dans une taille suffisamment petite pour tenir dans des plaques à 6 puits (environ 2,5 cm x 2,5 cm).

3. Construction de multicouches de polyélectrolytes (PEM)

REMARQUE : Ce protocole décrit le revêtement plasma avec un réservoir d’oxygène sous pression attaché et un accessoire de mélange de gaz (voir le tableau des matériaux). Toute méthode de nettoyage uniforme au plasma de la surface du polystyrène de culture tissulaire (TCPS) convient. Il peut être nécessaire d’optimiser le temps et l’intensité par l’utilisateur lors de l’utilisation d’une autre méthode de nettoyage au plasma.

1. Nettoyez au plasma une plaque à 6 puits pendant 7 min.
   1. Purgez la chambre en tournant la vanne à trois voies à l’avant de la porte vers la droite jusqu’à ce que le sifflement de l’air se fasse entendre. Remettez la vanne à trois voies en position verticale une fois que la lecture de pression est supérieure à 1800 mTorr.
   2. Ouvrez la porte et placez la plaque à 6 puits dans la chambre. Fermez la porte et allumez la pompe à vide. Évacuez la chambre jusqu’à ce que la pression soit stable autour de 100 mTorr.
      REMARQUE : Pendant que la chambre s’évacue, vérifiez que le réservoir d’oxygène est ouvert et que la pression de sortie de l’oxygène est de 10 psi.
   3. Ouvrez la vanne à trois voies vers la gauche pour aligner la conduite avec le tuyau d’entrée d’oxygène. Laissez l’oxygène gazeux s’écouler dans la chambre jusqu’à ce que la pression se stabilise entre 400 et 450 mTorr.
      REMARQUE : Confirmez que la pression d’entrée sur le débitmètre est de 10 mm et ajustez si nécessaire.
   4. Mettez l’alimentation RF sous tension. Attendez que le plasma se forme (~15 s), puis démarrez la minuterie pendant 7 min.
   5. Après 7 min, coupez l’alimentation RF et remettez la vanne à trois voies en position verticale. Laisser la chambre s’évacuer à 150 mTorr.
   6. Éteignez la pompe à vide et attendez que la pression monte à 1500 mTorr. Aérez la chambre en tournant la soupape à trois voies vers la droite jusqu’à ce que le sifflement de l’air puisse être entendu. Lorsque la pression est supérieure à 1800 mTorr, remettez la vanne à trois voies en position verticale, ouvrez la porte et récupérez l’échantillon.
2. Placez les plaques recouvertes de plasma dans les bains à température ambiante comme suit : PDAC pendant 20 min, eau DI pendant 5 min, eau DI pendant 5 min, SPS pendant 20 min, eau DI pendant 5 min et eau DI pendant 5 min. Assurez-vous que toute la surface de la plaque est immergée.
   REMARQUE : En option, un colorateur de lames automatisé peut être utilisé pour réduire le temps actif. Utilisez une agitation douce, si possible.
3. Répétez l’étape précédente 10 fois au total. Laissez les plaques sécher à l’air.
   REMARQUE : Les plaques séchées peuvent être conservées à température ambiante jusqu’à plusieurs semaines avant d’être utilisées.

4. Structuration PEM par micromoulage dans les capillaires

1. Lavez les tampons PDMS avec un savon de laboratoire doux suivi d’eau DI. Séchez les tampons à l’aide d’un compresseur d’air et placez-les sur une surface plane et mobile, comme un couvercle de plaque à 6 puits inutilisé.
   EN OPTION : Les tampons peuvent également être séchés à l’air. Les tampons doivent être couverts et protégés de la poussière pendant le séchage.
2. Appliquez une couche plasma sur les tampons, comme décrit à l’étape 3, pendant 1 min. Retirez rapidement les tampons du nettoyeur plasma et placez-les face cachée sur les plaques à 6 puits préparées.
3. Pipetez 10 μL de solution PDAC le long du bord inférieur du tampon, en distribuant régulièrement le polymère sur toute la longueur du tampon. Assurez-vous d’ajouter le polymère sur le côté du tampon avec des ouvertures à partir des motifs de lignes pour permettre à l’action capillaire d’avoir lieu.
4. Placez un poids de 350 g sur chaque tampon pendant 20 s pour aider à renforcer le motif. Laissez reposer les tampons sur les plaques pendant 20 min.
5. Trempez la plaque dans de l’eau DI et décollez les tampons dans le sens des motifs de lignes. Lavez la plaque deux fois pendant 5 minutes chacune dans de l’eau DI.
6. Lavez les tampons avec du savon et de l’eau DI et séchez-les avec un compresseur d’air. Laissez la plaque sécher à l’air.
7. Si elles sont prêtes pour la culture cellulaire, stérilisez les plaques sous la lumière UV dans une cagoule de biosécurité de classe II pendant au moins 8 heures immédiatement avant l’utilisation. La dose minimale recommandée d’UV-C totaux est de 400 mJ/^cm2 à 265 nm. Si vous visualisez des motifs, sautez l’étape de stérilisation UV et effectuez l’étape 5. S’il est prêt pour la culture cellulaire, effectuez l’étape 6 après la stérilisation UV.

5. Visualisation de motifs estampés avec de la carboxyfluorescéine (CFSE)

REMARQUE : Effectuez cette procédure pour visualiser les motifs estampés ou sautez cette étape et préparez plutôt des motifs pour la culture cellulaire. Une fois que les motifs sont colorés, ils ne peuvent pas être utilisés pour la culture cellulaire. Une fois que l’on a acquis une confiance suffisante dans l’estampage, les motifs peuvent être utilisés pour la culture cellulaire. La carboxyfluorescéine est sensible à la lumière. Tache et transport dans l’obscurité.

1. Placer les motifs secs et estampés dans une solution de coloration de motif CFSE (0,1 μM CFSE dans 0,1 M NaOH) pendant 60 à 90 min. Laver les motifs estampés pendant 5 min en DI H₂O deux fois.
   REMARQUE : Si vous utilisez des lames de verre, placez la lame entière dans un tube de 50 ml contenant la solution de coloration. Si vous utilisez des plaques à puits, ajoutez suffisamment de solution de coloration pour couvrir tout le motif.
2. Visualisez les motifs à l’aide d’un microscope à fluorescence approprié.
   1. Allumez l’ampoule fluorescente pour lui permettre de se réchauffer pendant 10 min. Étant donné que les motifs sont colorés avec CFSE, utilisez le filtre bleu d’interférence (IB) pour visualiser les motifs verts. Visualisez les motifs et prenez des photos.

6. Coloration et ensemencement des cellules de glioblastome avec de la carboxyfluorescéine

REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité de classe II appropriée.

1. Détacher les cellules de la surface de la culture avec 0,25 % de trypsine-EDTA, centrifuger à 200 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant.
2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture cellulaire sans sérum (DMEM et pénicilline-streptomycine à 1 %), centrifuger à 200 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant.
3. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS et transférer dans un tube stérile de 1,5 mL. Ajouter 10 μL de 10 μg/mL CFSE et bien mélanger immédiatement en pipetant de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 10 min et transférer dans un tube stérile de 15 ml.
4. Ajouter au moins 1 mL de milieu de culture cellulaire (voir l’étape 1.2.2.1) pour éteindre la réaction du colorant CFSE. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de culture cellulaire et les transférer dans un tube stérile frais de 15 mL.
5. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de culture cellulaire.
6. Répétez deux fois l’étape de lavage précédente.
7. Ensemencez les cellules de gliome colorées (100 cellules/mm² ou 100 000 cellules/puits) dans la plaque de culture tissulaire à 6 puits à motifs de l’étape 4 avec un milieu de culture d’astrocytes. Cultivez les cellules dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pendant 24 h avant d’ajouter les astrocytes colorés à l’étape 7.

7. Coloration et ensemencement des astrocytes primaires avec PKH26

REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité de classe II appropriée.

1. Détacher les cellules de la surface de la culture avec 0,25 % de trypsine-EDTA, centrifuger à 200 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant.
2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture cellulaire sans sérum (DMEM et pénicilline-streptomycine à 1 %), centrifuger à 200 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant.
3. Préparez une suspension cellulaire 2x en remettant en suspension la pastille de cellule dans 0,5 mL de diluant C à température ambiante du kit PKH26.
4. Préparez une solution de colorant 2x (4 x ^10-6 M) en ajoutant 2 μL de PKH26 à 0,5 mL de diluant C dans un tube stérile de 1,5 mL. Préparez la solution de colorant juste avant de l’utiliser.
5. Ajouter une suspension de cellules 2x à une solution de colorant 2x et mélanger immédiatement en pipetant de haut en bas.
6. Incuber la suspension cellulaire pendant 1 à 5 min.
   REMARQUE : La coloration se produit rapidement et le diluant C est nocif pour les cellules. Une incubation plus longue ne signifie pas une meilleure teinture.
7. Trempez la coloration en ajoutant un volume minimum de 5x du milieu de culture cellulaire et en incubant pendant 1 min pour lier l’excès de colorant.
8. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer délicatement le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de culture cellulaire et les transférer dans un nouveau tube stérile de 15 mL.
9. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 5 mL de PBS.
10. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 5 mL de milieu de culture cellulaire.
11. Répétez les étapes 7.9 et 7.10 pour un total de trois lavages.
12. Ensemencez les astrocytes colorés (200 cellules/^mm2 ou 200 000 cellules/puits) avec un milieu astrocytaire (voir étape 1.2.2.1) dans la plaque de culture tissulaire à 6 puits pré-ensemencée avec des cellules de gliome de l’étape 6. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C, à 5 % de CO₂ pendant la durée des expériences.

8. Imagerie par fluorescence de la mono-culture et de la co-culture à motifs

1. Allumez l’ampoule fluorescente pour lui permettre de se réchauffer pendant 10 min.
2. Retirez la culture cellulaire de l’incubateur et placez-la sur la platine d’un microscope inversé capable d’imagerie par fluorescence.
3. Insérez ou fixez le filtre approprié. Si les cellules imagées sont colorées avec CFSE, utilisez le filtre bleu d’interférence (IB) pour visualiser les cellules vertes. Si les cellules imagées sont colorées avec PKH26, utilisez un filtre à rhodamine pour visualiser les globules rouges.
4. Observez l’échantillon et prenez des photos.
   REMARQUE : Les cellules peuvent maintenant être séparées à l’aide de la cytométrie en flux pour analyser les effets biologiques de la communication par contact.

Le protocole décrit ici l’ingénierie de la co-culture par contact direct de cellules de gliome et d’astrocytes. Cette plateforme fournit un modèle multicellulaire biomimétique pour étudier le rôle du contact direct dans la communication entre les astrocytes et les cellules de gliome dans la progression du glioblastome multiforme (GBM). La figure 1 présente un schéma de la modification de surface étape par étape et de l’introduction cellulaire...

Les étapes critiques pour assurer le succès de l’assemblage d’une co-culture reproductible comprennent : 1) la modélisation réussie de la surface par micromoulage dans les capillaires, 2) le lavage réussi des cellules colorées, et 3) l’analyse de la co-culture dans la fenêtre de « culture mature ». Tout d’abord, la reproduction réussie de motifs par micromoulage dans les capillaires est essentielle à la reproductibilité de l’interaction, car c’est ce qui distingue...

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ce travail a été soutenu, en tout ou en partie, par les subventions 1R01AA027189-01A1 (à S.K.), P20 GM104320 (au Nebraska Center for the Prevention of Obesity Diseases Pilot Grant à S.K.), P20 GM113126 (au Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication-Project Leader S.K.) ; Subvention de démarrage biomédicale du Bureau de la recherche et du développement de l’UNL et subvention de l’Initiative de recherche du Nebraska-Systèmes (à S.K.). K.M.S. a été financé par T32GM107001, une subvention de formation.