Идентификация источника секретируемых белков в почках с помощью инъекции Брефельдина А

Идентификация типа клеток, ответственных за секрецию цитокинов, необходима для понимания патобиологии заболевания почек. Здесь мы описываем метод количественного окрашивания почечной ткани на цитокины, продуцируемые эпителиальными или интерстициальными клетками почек, с использованием брефельдина А, ингибитора секреции, и маркеров, специфичных для клеточного типа.

Хроническая болезнь почек (ХБП) входит в десятку основных причин смерти в США. Острое повреждение почек (ОПП), хотя и часто излечимое, предрасполагает пациентов к ХБП в более позднем возрасте. Эпителиальные клетки почек были определены в качестве ключевых сигнальных узлов как при ОПП, так и при ХБП, благодаря чему клетки могут определять течение заболевания посредством секреции цитокинов и других белков. В частности, при ХБП несколько линий доказательств продемонстрировали, что неадаптивно восстановленные канальцевые клетки стимулируют прогрессирование заболевания за счет секреции трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и других профибротических цитокинов. Тем не менее, идентификация источника и относительного количества секретируемых белков из различных типов клеток in vivo остается сложной задачей.

В данной статье описана методика использования брефельдина А (БФА) для предотвращения секреции цитокинов, что позволяет окрашивать цитокины в почечной ткани с использованием стандартных иммунофлуоресцентных методов. БЖК ингибирует транспортировку эндоплазматического ретикулума (ЭР) к аппарату Гольджи, который необходим для секреции цитокинов и других белков. Инъекция БФА за 6 ч до жертвоприношения приводит к накоплению TGF-β, PDGF и CTGF внутри клеток проксимальных канальцев (ПТК) в мышиной модели цисплатина ОПП и TGF-β в мышиной модели ХБП на основе аристолоховой кислоты (АА). Анализ показал, что БФА + цисплатин или БФА + АА значительно увеличивают TGF-β положительный сигнал по сравнению с БФА + физиологическим раствором, цисплатином или только АА. Эти данные свидетельствуют о том, что БФА может быть использована для идентификации типа клеток, продуцирующих конкретные цитокины, и количественной оценки относительных количеств и/или различных типов производимых цитокинов.

По оценкам, >10% населения мира имеют ту или иную форму заболевания почек¹. Определяемый быстрым началом, ОПП в значительной степени излечим; однако эпизод ОПП может предрасполагать пациентов к развитию ХБП в более позднем возрасте ^2,3. В отличие от ОПП, ХБП характеризуется прогрессирующим фиброзом и ухудшением функции почек, что приводит к терминальной стадии почечной недостаточности, требующей заместительной почечной терапии. Большинство повреждений почек нацелены на специализированные эпителиальные клетки, такие как подоциты или клетки проксимальных канальцев, которые составляют нефрон ^4,5. После повреждения выжившие эпителиальные клетки помогают координировать реакцию восстановления за счет секреции цитокинов и других белков. Таким образом, выжившие клетки могут модулировать иммунный ответ, направлять ремоделирование внеклеточного матрикса и способствовать восстановлению органов.

Цитокины представляют собой небольшие секретируемые белки, необходимые для модуляции созревания, роста и реакции многоклеточных организмов ^6,7. Они функционируют как посланники сигналов между различными типами клеток, включая иммунные и эпителиальные клетки⁸. Хотя считается, что цитокины секретируются в основном иммунными клетками, долгосрочные исследования показали, что эпителиальные и интерстициальные клетки почек также секретируют цитокины в качестве сигналов для других резидентных клеток почек, таких как клетки канальцев, интерстициальные клетки и иммунные^{клетки.} ПТК, в частности, играют важную роль в начале и на этапе восстановления после ОПП¹¹. Тем не менее, известно, что неадаптивно репарируемые ПТК секретируют профибротические цитокины, такие как трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста-D (PDGF-D) и фактор роста соединительной ткани (CTGF), способствуя прогрессированию ХБП¹². Таким образом, эпителиальные клетки почек используют секретируемые цитокины для модуляции повреждения почек.

Хотя известно, что эпителиальные клетки почек секретируют цитокины, точный источник и относительный вклад каждого типа клеток было трудно определить из-за технических сложностей изучения^{секретируемых белков}. Проточная цитометрия, распространенный подход, используемый для измерения цитокинов, является сложной задачей для лечения поврежденных почек, особенно в сильно фиброзных. С помощью Cre-рекомбиназы, управляемой промотором цитокинов, мышей-репортеров цитокинов часто используют для идентификации типа клеток, экспрессирующих данный цитокин. Тем не менее, использование репортерных мышей ограничено из-за необходимости скрещивания репортерных мышей с различными нокаутными фонами, отсутствия подходящих репортеров и того факта, что одновременно может быть проанализирован только один цитокин. Таким образом, необходимо разработать простую, универсальную и доступную методику обнаружения цитокин-высвобождающих клеток почек.

Мы предположили, что инъекция BFA, ингибитора секреции, который блокирует транспорт эндоплазматического ретикулума-Гольджи in vivo, позволит окрашивать секретируемые белки в почечной ткани (рис. 1A,B), как показано с помощью анализов на основе проточной цитометрии^14,15. Наряду с клеточно-специфическими производителями, этот метод может быть использован для определения источника и относительного вклада цитокин-продуцирующих клеток в поврежденных почках. В отличие от образцов для проточной цитометрии, неподвижные ткани могут сохраняться в течение длительного времени с сохранением белков и клеточных структур, что позволяет проводить более тщательное исследование секреторных клеток. Чтобы проверить эту гипотезу, почки мышей повреждали с помощью модели ОПП (цисплатин) и модели ХБП (нефропатии аристолоховых кислот (ААН)), вводили БФА и окрашивали с помощью стандартных иммунофлуоресцентных методов.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом использования животных, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и пользователям Медицинского центра Университета Вандербильта.

1. Животные

1. Используйте 8-12-недельных самцов мышей BALB/c (масса тела: около 25 г) для лечения нефропатии, вызванной цисплатином или аристолоховой кислотой.
2. Убедитесь, что мыши здоровы и у них нет явных признаков стресса или ран от боя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раны, особенно на хвосте, могут мешать описанному здесь протоколу. Мыши BALB/c были выбраны потому, что у этих мышей легче визуализировать хвостовую вену для инъекции. Описанный здесь протокол работает для других линий мышей; Однако дозировка цисплатина или аристолоховой кислоты может отличаться в зависимости от штамма.

2. Инъекция цисплатина

1. Растворите цисплатин в стерильном физиологическом растворе до конечной концентрации 1 мг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цисплатин не растворится полностью при комнатной температуре. Его следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
2. Нагрейте раствор цисплатина на водяной бане при температуре 37 °C и многократно перемешайте до полного растворения цисплатина.
3. Взвесьте мышей и рассчитайте объем раствора цисплатина, необходимый для введения 20 мг/кг массы тела (м.т.).
4. Продезинфицируйте кожу живота с помощью повидон-йодных (7,5%) и спиртовых (70%) тампонов, чередуя их по 3 раза.
5. С помощью инсулинового шприца с иглой 25 G введите раствор цисплатина внутрибрюшинно.
6. Приступайте к разделу 4 на 3 день после инъекции.

3. Введение аристолоховой кислоты (ААК)

1. Растворите аристолоховую кислоту-I в фосфатно-солевом буфере (PBS) в конечной концентрации 0,5 мг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: АА следует обрабатывать в вытяжном шкафу. Следует использовать АА-I, так как это доминирующая форма, вызывающая повреждение почек.
2. Нагрейте раствор АА на водяной бане при температуре 37 °C и многократно перемешайте до полного растворения.
3. Взвесьте мышей и рассчитайте объем раствора АК для введения 5 мг/кг массы тела.
4. Продезинфицируйте кожу живота с помощью повидон-йода (7,5%) и спиртового (70%) тампона 3х.
5. С помощью инсулинового шприца с иглой 25 Г введите раствор АК внутрибрюшинно.
6. Вводите АК через день, всего 3 инъекции.
7. Приступайте к разделу 4 на 42 день после последней инъекции.

4. Приготовление раствора БФА

1. Растворите БФА в диметилсульфоксиде в концентрации 10 мг/мл до получения исходного раствора.
2. Храните исходный раствор при температуре -20 °C.
3. Разбавить стоковый раствор БФА стерильным PBS до конечной рабочей концентрации 1,25 мг/мл
   ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий рабочий раствор каждый раз непосредственно перед инъекцией.

5. Инъекция БФА в хвостовую вену

1. Перед инъекцией наполовину наденьте, наполовину снимите грелку на 10 минут, чтобы мыши были в тепле, чтобы предотвратить падение температуры тела, которое может вызвать сужение сосудов в хвосте и помешать инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите клетку на грелки так, чтобы половина клетки находилась на подушке, а половина - нет. Таким образом, когда мыши почувствуют тепло, они могут переместиться на другую сторону клетки и наоборот.
2. Удерживайте мышей с помощью имеющихся в продаже удерживающих устройств соответствующего размера.
3. Продезинфицируйте хвост с помощью повидон-йода и спиртового тампона три раза, как описано выше.
4. Держите хвост горизонтально и визуализируйте боковые хвостовые вены (Рисунок 1C). Используйте источник света под хвостом, чтобы визуализировать вены.
5. Введите иглу 28 G, держа иглу и шприц параллельно вене по направлению головки.
6. Введите 200 мкл раствора БЖК в дозе 1,25 мг/мл (0,25 мг БФА). Подождите, пока вена станет чистой, когда кровь будет заменена раствором для инъекции, что указывает на то, что инъекция прошла успешно.
7. Извлеките иглу и аккуратно надавите на хвост до тех пор, пока кровотечение не остановится.
8. Верните мышей в клетку и следите за ними на предмет дополнительного кровотечения или признаков дистресса.

6. Жертвоприношение и сбор урожая почек

1. Усыпить мышей с помощью передозировки изофлурана с последующим вывихом шейки матки через 6 ч после введения БФА.
   Примечание: 6-часовая временная точка была выбрана на основании литературы, демонстрирующей, что 6-часовая обработка БЖК в других органах обеспечивает достаточное накопление цитокинов в клетках для их визуализации с помощью иммунофлуоресцентного^{окрашивания16}.
2. Сразу после жертвоприношения обнажите брюшную полость и сердце мыши с помощью вентрального разреза по средней линии.
3. Соберите 100-500 мкл крови для анализа азота мочевины (АМК) крови с помощью пункции сердца. Используйте иглы 25 г с инсулиновыми шприцами объемом 1 мл для сбора крови. Для предотвращения коагуляции добавьте 5 мкл раствора гепарина (100 мг/15 мл dH₂O) в каждый образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа на мочевину необходимо минимум 20 μл крови; тем не менее, около 500 мкл может быть собрано с помощью пункции сердца после эвтаназии, что может быть полезно для других анализов. Соберите как можно больше крови.
4. Храните образцы крови на льду до тех пор, пока почки не будут собраны в разделе 7 ниже.
   1. Центрифугируйте образцы крови при концентрации 1300 × г в течение 10 минут.
   2. Аккуратно изолируйте плазму и храните ее при температуре -20 °C до тех пор, пока не будете готовы к проведению анализа АМК в разделе 17 ниже. В качестве альтернативы можно хранить образцы плазмы для анализа креатинина.

7. Перфузия и удаление почек

1. Перфузируют мышь 10-20 мл PBS через левый желудочек с помощью шприца объемом 20 мл со скоростью потока 2-4 мл/мин до тех пор, пока перфузат не станет прозрачным.
2. Удалите почки, удерживая почечную артерию и вену щипцами близко к сосочку и разрезав сосуды со стороны от почки.
3. Аккуратно извлеките капсулу из почки, отклеив ее рукой или с помощью пары тонких стерильных щипцов.
4. В зависимости от антитела переходят к разделу 8 для получения неподвижной ткани, залитой парафином, или к разделу 10 для получения неподвижной замороженной ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка тканей должна быть оптимизирована для каждого антитела, используемого для окрашивания.

8. Залитая парафином ткань для окрашивания TGF-β и PDGF-D

1. Разрежьте почку пополам, поместив ее на чистое предметное стекло и разрезав горизонтально новым лезвием бритвы. Поместите одну половинку в 10 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS на 24 ч на торцевой ротатор со скоростью 10 оборотов в минуту (об/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для секции не требуется целая почка. Одна половина почки может быть сохранена или использована для других анализов.
2. Замените PFA на 70% этанол.
3. На этой стадии почечную половину почки необходимо обработать и заложить парафином, затем разрезать залитые парафином почечные ткани с температурой 4-6 мкм с помощью микротома и установить их на предварительно очищенные, заряженные предметные стекла^17,18.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почки были обработаны и помещены в парафин с помощью общего ресурса трансляционной патологии Медицинского центра Университета Вандербильта и хранились при комнатной температуре.

9. Депарафинизация и регидратация

1. Поместите предметные стекла в решетку для окрашивания предметных стекол и опустите их в лунку для окрашивания, содержащую D-лимонен, на 5 минут, убедившись, что ткань полностью погружена в воду. Повторите в лунке, содержащей свежий D-лимонен.
2. Регидратируйте ткани, погружая предметные стекла в последовательные разведения этанола 100% (2x), 95%, 90% и 70% в течение 5 минут каждое.
3. Промойте предметные стекла в проточной dH₂O в течение 5 минут.
4. Выполните извлечение антигена путем инкубации секций в цитратном буфере (pH 6,0) в скороварке при 121 °C и 15 фунтах на квадратный дюйм в течение 45 минут.
5. Промойте предметные стекла в проточной dH₂O в течение 20 минут.
6. Перейдите к разделу 12.

10. Подготовка замороженной ткани к окрашиванию CTGF

1. Рассеките почку пополам по горизонтальной оси с помощью свежего лезвия бритвы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для секции не требуется целая почка. Одна половина почки может быть сохранена или использована для других анализов.
2. Поместите половинку почки в 10 мл 0,5% PFA в пробирку объемом 15 мл на ротатор на 2 ч при 4 °C со скоростью 10 об/мин.
3. Сцедите PFA в контейнер для правильной утилизации и добавьте 10 мл 0,1 М глицина в PBS на 1 ч при 4 °C со скоростью 10 об/мин.
4. Сцедите глицин, добавьте 10 мл 15% сахарозы, растворенной в PBS, и поместите пробирку на вращатель на ночь при температуре 4 °C и 10 оборотах в минуту.
5. Сцедите 15% сахарозу и замените 10 мл 30% сахарозы, растворенной в PBS, на 1 ч при 4 °C и 10 об/мин.
6. Заполните форму для заделки составом для оптимальной температуры резки (OCT) и заложите половину почки с шага 10.5 поверхностью среза почки вниз.
7. Осторожно поместите форму, содержащую половинку почки и ОКТ, в лужу с жидким азотом для замерзания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте жидкому азоту напрямую контактировать с OCT, так как это может привести к образованию пузырьков. При использовании жидкого азота необходимо носить надлежащие средства индивидуальной защиты, такие как защитные очки/лицевой щиток, криогенные перчатки и лабораторный халат. Лучше всего использовать длинные, ~25 см, щипцы для помещения форм в жидкий азот.
8. После замерзания в твердом состоянии храните форму при температуре -80 °C.

11. Замороженная секция

1. Убедитесь, что криостат находится при температуре -20 °C.
2. Пресс-формы, содержащие образцы в ОКТ, хранят в криостате при температуре -20 °C в течение 2 ч для выравнивания температуры.
3. Снимите форму, удерживая язычки и надавливая снизу.
4. Поместите свежий ОКТ на держатель образца и поместите сверху замороженный блок образца стороной ткани в сторону от держателя образца.
5. Поместите держатель и образец на полку для заморозки.
6. Поместите утяжеленный теплоотвод на верхнюю часть блока, чтобы выровнять поверхность. Держите крышку криостата закрытой, когда она не используется, чтобы предотвратить колебания температуры.
7. После того как свежая ОКТ между блоком образца и держателем образца будет заморожена, проверьте надежность соединения.
8. Зажмите держатель образца на микротомной головке криостата.
9. Начинайте делать срезы до тех пор, пока ткань не станет видимой в блоке образца.
10. Срезы почечной ткани с температурой 4-6 мкм и срезы поднимаются на предметное стекло комнатной температуры¹⁹.
11. После того, как салфетка будет собрана, храните предметное стекло при температуре от -20 °C до -80 °C до тех пор, пока оно не будет готово к окрашиванию. Не позволяйте ему оттаять до тех пор, пока он не будет готов начать окрашивание.
12. Перед окрашиванием извлеките предметное стекло (стекла) из хранилища и дайте нагреться до комнатной температуры. Не допускайте высыхания секций.
13. Получив комнатную температуру, немедленно промойте срезы PBS в течение 5 мин дважды при комнатной температуре, чтобы удалить соединение OCT.
14. Перейдите к разделу 12.

12. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Наметьте срезы тканей гидрофобным барьерным маркером. Расстояние от ткани до контура гидрофобного барьера должно быть не менее 5 мм.
2. Добавьте 50 μL блокирующего буфера, содержащего 3% сыворотки осла и 0,1% Triton в 1% бычьего сывороточного альбумина/трис-буферизованного физиологического раствора (TBS) поверх среза и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре во увлажненной камере.
3. Разведите первичные антитела с PBS в соответствующей концентрации. Для обнаружения цитокинов используют 50 мкл растворов первичных антител, направленных против TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) и CTGF (1:200). Для мечения миофибробластов используют 50 мкл раствора первичного антитела, направленного против альфа-гладкомышечного актина (α-СМА), конъюгированного с Cy3 в соотношении 1:200.
4. Удалите блокирующий раствор и добавьте первичные антитела в срез, следя за тем, чтобы он не вытекал из круглого гидрофобного контура, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C во увлажненной камере. Повторно нанесите гидрофобный барьер, если происходит утечка.
5. Промыть 3 раза с PBS в течение 5 минут.
6. Разведите соответствующие вторичные антитела в соотношении 1:200 с PBS.
7. Образцы инкубируют с 50 мкл растворов вторичных антител в течение 1 ч при комнатной температуре во увлажненной камере.
8. Промыть с PBS в течение 5 минут.
9. Разбавленный лектин lotus tetragonolobus (LTL), конъюгированный с флуоресцеином в PBS с^Ca2+ и Mg²⁺ в концентрации 10 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ca²⁺ и Mg²⁺ необходимы для связывания LTL.
10. Инкубировать ткани с 50 μл раствора LTL в течение 30 минут при комнатной температуре в увлажненной камере.
11. Умываться PBS с Ca²⁺ и Mg²⁺ в течение 5 минут.
12. Инкубировать с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 5 мкг/мл в воде) для окрашивания ДНК/ядер в течение 5 мин при комнатной температуре.
13. Установите покровные стекла, добавив 20 μл реагента для защиты от выцветания на ткань и медленно установив покровное стекло. Подождите 24 часа, пока реагент против выцветания затвердеет перед визуализацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание лектина может со временем ухудшаться, что приводит к потере сигнала. Лучше всего визуализировать окрашенные лектином образцы вскоре после установки монтажного реагента. Если наблюдается потеря сигнала, в монтажный реагент можно добавить Ca²⁺ и Mg²⁺ для сохранения окрашивания.

13. Получение изображения

1. Включите инвертированный микроскоп (см. Таблицу материалов) с автоматизированным двухкоординатным столиком.
2. Выберите цель 20x.
3. Откройте программное обеспечение для получения изображений (см. Таблицу материалов).
4. Нажмите на кнопку Live , чтобы открыть окно просмотра в реальном времени.
5. Найдите участок ткани и убедитесь, что он находится в фокусе.
6. Нажмите на меню «Получить » и выберите «Сканировать большое изображение».
7. В окне «Сканировать большое изображение » настройте область для сканирования, переместив рабочую область с помощью джойстика в крайнюю левую часть участка ткани и щелкнув стрелку влево. Повторите то же самое для верхнего, самого правого и нижнего сегментов тканей.
8. Нажмите на меню приобретения .
9. Убедитесь, что установлен флажок для большого изображения.
   1. При съемке многоканальных изображений перейдите на вкладку «Лямбда ».
   2. Нажмите на каждый канал и установите время экспозиции на уровне, при котором окрашивание будет заметным без насыщения какой-либо части изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки должны быть согласованы в пределах одной экспериментальной группы. Изменение настроек сбора данных между образцами приведет к неточным результатам.
   3. Повторите шаг 9.2 для каждого канала, который нужно собрать.
10. Нажмите « Сканировать».

14. Анализ изображений

1. Откройте программу для получения изображений.
2. Нажмите «Файл» | Откройте и выберите изображение.
3. Щелкните правой кнопкой мыши по окну изображения и выберите полигональную область интереса (ROI).
4. Наметьте окупаемость инвестиций с помощью инструмента «От руки ». Наметьте LTL-положительные клетки канальцев или α-SMA-положительные интерстициальные клетки.
5. Перейдите на вкладку «Измерение» | Порог.
6. Установите верхнюю и нижнюю границы порога, отрегулировав ползунки по обе стороны от области положительного сигнала.
7. Перейдите на вкладку ROI .
8. Нажмите на значок «Экспорт », чтобы сохранить значения. Используйте программное обеспечение для работы с электронными таблицами для вычисления процента площади положительного сигнала/области ROI.

15. Альтернатива: Анализ изображений с помощью бесплатного программного обеспечения (ImageJ)

1. Откройте ImageJ.
2. Нажмите «Файл» | Откройте для просмотра изображения.
3. Нажмите на выбранные от руки варианты от руки.
4. Выберите ROI , обведя контур с помощью инструмента от руки . Наметьте LTL-положительные клетки канальцев или α-SMA-положительные интерстициальные клетки.
5. Щелкните меню «Правка» и выберите «Очистить снаружи».
6. Нажмите кнопку Анализ и выберите Измерить, чтобы определить область ROI.
7. Перейти к изображению | Цвет | Разделение каналов.
8. Отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога для обнаружения области положительного сигнала.
9. Нажмите кнопку Анализ и выберите Измерить.
10. Сохраните данные.
11. Откройте данные с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами и рассчитайте отношение площади положительного сигнала к площади ROI.

16. Опционально: визуализация с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений с более высоким разрешением для публикации сканирующая конфокальная микроскопия обеспечивает более четкие изображения и уменьшение фона в почечной ткани.

1. Включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (см. Таблицу материалов).
2. Выберите цель 40x (см. Таблицу материалов).
3. Нажмите вкладку «Найти» и найдите ткани, настроив фокус.
4. Перейдите на вкладку Acquisition (Acquisition Acquisition ), нажмите Channels (Каналы) и выберите 1 AU в параметре pinhole.
5. Отрегулируйте интенсивность усиления лазера в каждом канале таким образом, чтобы положительный сигнал был виден, но не насыщен. Убедитесь, что настройки в наборе экспериментальных образцов остаются постоянными.
6. Нажмите «Привязать» и сохраните изображение в нужном формате.

17. Уровень амбициозности в плазме

1. Снимите образцы с температуры -20 °C и разморозьте их на льду.
2. Разбавьте плазму dH₂O в соотношении 1:10.
3. Для каждого образца настройте три отдельные реакции в двух экземплярах в 96-луночном планшете.
   1. Для образца плюс стандарт добавьте 5 мкл 200 мг/дл мочевины и 20 мкл разбавленной плазмы.
   2. Только для образца добавьте 5 μL_dH2O и 20 μL разбавленной плазмы.
   3. В качестве бланка образца добавьте 5 мкл dH₂O и 20 мкл разбавленной плазмы.
4. Смешайте 85 мкл реагента + 1 мкл уреазы на образец для приготовления рабочего раствора.
5. Добавьте 80 мкл рабочего раствора в лунки «образец плюс стандарт» и «только образец».
6. Добавьте 80 μL реагента (без уреазы) в лунку для «образца» из шага 17.3 выше.
7. Осторожно постучите по тарелке, чтобы перемешать и выдержать в течение 5 минут при комнатной температуре.
8. Чтение OD₅₆₀ с помощью считывателя пластин.
9. Рассчитайте концентрацию мочевины Eq (1) и преобразуйте ее в мочевину с помощью Eq (2).
   Мочевина (мг/дл) = (Только проба - Пустой образец)/(Стандартная - только проба) x (Стандартная/4) x (Коэффициент разбавления) (1)
   МОЧЕВИНА (мг/дл) = концентрация мочевины/2,14 (2)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ измеряет содержание мочевины (молекулярная масса: 60) в сыворотке; однако BUN относится только к содержанию азота в мочевине (молекулярная масса: 28). Таким образом, необходима коррекция 2,14 (60/28) для перевода концентрации мочевины в АМК.

Для изучения роли канальцевых эпителиальных клеток в продукции цитокинов после цисплатин-индуцированного ОПП цисплатин вводили цисплатин в концентрации 20 мг/кг с последующей внутривенной инъекцией 0,25 мг БЖК на 3-й день после инъекции цисплатина. Почки были собраны ч...

Известно, что почечные ПТК регулируют ОПП и ХБП посредством секреции TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, фактора роста эндотелия сосудов, а также многих других белков 20,21,22,23. Аналогичным образом, клубочки, дистальные к?...

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Американская кардиологическая ассоциация (AHA): Кенсей Тагути, 20POST35200221; HHS | НИЗ | Национальный институт диабета, болезней пищеварительной системы и почек (NIDDK): Крейг Брукс, DK114809-01 DK121101-01.