Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Method Article
L’identification du type de cellule responsable de la sécrétion de cytokines est nécessaire pour comprendre la pathobiologie de la maladie rénale. Ici, nous décrivons une méthode pour colorer quantitativement le tissu rénal pour les cytokines produites par les cellules épithéliales ou interstitielles rénales à l’aide de la bréfeldine A, un inhibiteur de sécrétion, et de marqueurs spécifiques au type de cellule.
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est l’une des dix principales causes de décès aux États-Unis. L’insuffisance rénale aiguë (IRA), bien que souvent guérissable, prédispose les patients à l’IRC plus tard dans la vie. Les cellules épithéliales rénales ont été identifiées comme des nœuds de signalisation clés dans l’IRA et l’IRC, par lesquels les cellules peuvent déterminer l’évolution de la maladie grâce à la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. Dans l’IRC en particulier, plusieurs éléments de preuve ont démontré que les cellules tubulaires mal réparées entraînent la progression de la maladie par la sécrétion du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), du facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) et d’autres cytokines profibrotiques. Cependant, l’identification de la source et du nombre relatif de protéines sécrétées par différents types de cellules in vivo reste difficile.
Cet article décrit une technique utilisant la brefeldine A (BFA) pour empêcher la sécrétion de cytokines, permettant la coloration des cytokines dans le tissu rénal à l’aide de techniques d’immunofluorescence standard. Le BFA inhibe le transport du réticulum endoplasmique (RE) vers l’appareil de Golgi, qui est nécessaire à la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. L’injection de BFA 6 h avant le sacrifice entraîne une accumulation de TGF-β, de PDGF et de CTGF à l’intérieur des cellules des tubules proximaux (PTC) dans un modèle murin de cisplatine de l’IRA et du TGF-β dans un modèle murin d’acide aristolochique (AA) de l’IRC. L’analyse a révélé que BFA + cisplatine ou BFA + AA augmentait significativement le signal positif TGF-β par rapport à BFA + solution saline, cisplatine ou AA seul. Ces données suggèrent que la BFA peut être utilisée pour identifier le type de cellule produisant des cytokines spécifiques et quantifier les quantités relatives et/ou les différents types de cytokines produites.
On estime que >10 % de la population mondiale souffre d’une forme de maladie rénale1. Définie par son apparition rapide, l’IRA est en grande partie curable ; cependant, un épisode d’IRA peut prédisposer les patients à développer une MRC plus tard dans la vie 2,3. Contrairement à l’IRA, l’IRC est caractérisée par une fibrose progressive et une aggravation de la fonction rénale, conduisant à une insuffisance rénale terminale nécessitant un traitement de remplacement rénal. La plupart des lésions rénales ciblent les cellules épithéliales spécialisées, telles que les podocytes ou les cellules tubulaires proximales, qui composent le néphron 4,5. Après une blessure, les cellules épithéliales survivantes aident à coordonner la réponse de réparation par la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. De cette façon, les cellules survivantes peuvent moduler la réponse immunitaire, diriger le remodelage de la matrice extracellulaire et aider à la récupération des organes.
Les cytokines sont de petites protéines sécrétées essentielles à la modulation de la maturation, de la croissance et de la réactivité des organismes multicellulaires 6,7. Ils fonctionnent comme des messagers de signaux entre divers types de cellules, y compris les cellules immunitaires et épithéliales8. Bien que l’on pense que les cytokines sont sécrétées principalement par les cellules immunitaires, des recherches de longue date ont démontré que les cellules épithéliales et interstitielles rénales sécrètent également des cytokines comme signaux pour d’autres cellules rénales résidentes, telles que les cellules tubulaires, les cellules interstitielles et les cellules immunitaires 9,10. Les PTC, en particulier, jouent un rôle important dans la phase d’initiation et de récupération après l’IRA11. Cependant, les PTC mal réparés sont connus pour sécréter des cytokines profibrotiques telles que le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), le facteur de croissance dérivé des plaquettes-D (PDGF-D) et le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF), contribuant à la progression de l’IRC12. Ainsi, les cellules épithéliales rénales utilisent des cytokines sécrétées pour moduler les lésions rénales.
Bien que l’on sache que les cellules épithéliales rénales sécrètent des cytokines, la source exacte et la contribution relative de chaque type de cellule ont été difficiles à déterminer en raison des défis techniques liés à l’étude des protéines sécrétées13. La cytométrie en flux, une approche couramment utilisée pour mesurer les cytokines, est difficile à réaliser sur les reins lésés, en particulier chez les reins très fibreux. Avec la recombinase Cre pilotée par un promoteur de cytokines, les souris rapporteures de cytokines sont souvent utilisées pour identifier le type de cellule qui exprime une cytokine donnée. Cependant, l’utilisation de souris rapporteures est limitée en raison de la nécessité de croiser des souris rapporteures dans divers contextes de knock-out, du manque de rapporteurs appropriés et du fait qu’une seule cytokine peut être analysée à la fois. Ainsi, il est nécessaire de développer une technique simple, polyvalente et abordable pour détecter les cellules rénales libérant des cytokines.
Nous avons émis l’hypothèse que l’injection de BFA, un inhibiteur de sécrétion qui bloque le transport du réticulum endoplasmique-Golgi in vivo, permettrait la coloration des protéines sécrétées dans le tissu rénal (Figure 1A,B), comme le montrent les tests basés sur la cytométrie en flux14,15. Avec des fabricants spécifiques de type de cellule, cette technique pourrait être utilisée pour identifier la source et la contribution relative des cellules productrices de cytokines dans les reins lésés. Contrairement aux échantillons de cytométrie en flux, les tissus fixes peuvent être conservés à long terme avec la préservation des protéines et des structures cellulaires, ce qui permet une étude plus approfondie des cellules sécrétoires. Pour tester cette hypothèse, des reins de souris ont été blessés avec un modèle d’IRA (cisplatine) et un modèle de CKD (néphropathie acide aristolochique (NAA)), injectés avec BFA et colorés à l’aide de techniques immunofluorescentes standard.
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université Vanderbilt.
1. Animaux
2. Injection de cisplatine
3. Injection d’acide aristolochique (AA)
4. Préparation de la solution BFA
5. Injection de BFA dans la veine caudale
6. Sacrifice et récolte des reins
7. Perfusion et ablation des reins
8. Tissu inclus en paraffine pour la coloration TGF-β et PDGF-D
9. Déparaffinisation et réhydratation
10. Préparation de tissus congelés pour la coloration CTGF
11. Section congelée
12. Coloration par immunofluorescence
13. Acquisition d’images
14. Analyse d’images
15. Alternative : Analyse d’images avec un logiciel libre (ImageJ)
16. En option : Imagerie avec microscope confocal à balayage laser
REMARQUE : Pour obtenir des images à plus haute résolution pour la publication, la microscopie confocale à balayage fournit des images plus claires et un bruit de fond réduit dans le tissu rénal.
17. Taux plasmatique d’azote urétique
Pour examiner le rôle des cellules épithéliales tubulaires dans la production de cytokines après l’IRA induite par le cisplatine, le cisplatine a été injecté à une concentration de 20 mg/kg suivi d’une injection intraveineuse de 0,25 mg de BFA le jour 3 après l’injection de cisplatine. Les reins ont été prélevés 6 h plus tard. Des reins inclus dans de la paraffine ont été sectionnés et colorés avec du TGF-β, du PDGF-D et du CTGF, des cytokines représentatives res...
Les PTC rénaux sont connus pour réguler l’IRA et l’IRC par la sécrétion de TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ainsi que de nombreuses autres protéines 20,21,22,23. De même, les glomérules, les tubules distaux et d’autres cellules épithéliales rénales, ainsi que les cellules interstitielles, sécrèt...
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Association américaine du cœur (AHA) : Kensei Taguchi, 20POST35200221 ; Le HHS | NIH | Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) : Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL Insulin syringes | BD | 329654 | |
10 mL Syringe | BD | 302995 | |
2 mL tube | Fisher brand | 05-408-138 | |
20 mL Syringe | BD | 302830 | |
25 G needles | BD | 305125 | |
28 G needles | BD | 329424 | |
96-well-plate | Corning | 9017 | |
Aristolochic acid-I | Sigma-Aldrich | A9461 | |
α-SMA antibody conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | RRID:AB_476856 |
Blade for cryostat | C.L. Sturkey. Inc | DT315R50 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Brefeldin A | Sigma-Aldrich | B6542 | |
Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 791725 | |
Confocal microscope | ZEISS | LSM710 | |
Confocal microscopy objectives | ZEISS | 40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER | |
Confocal software | ZEISS | ZEN | |
Coplin jar | Fisher Scientific | 19-4 | |
Cover glass | Fisher brand | 12545F | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
CTGF antibody | Genetex | GTX124232 | RRID:AB_11169640 |
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 711-165-152 | RRID: AB_2307443 |
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 705-175-147 | RRID: AB_2340415 |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Disposable base molds | Fisher brand | 22-363-553 | |
donkey serum | Jackson immunoresearch | 017-000-121 | |
Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
Forceps | VETUS | ESD-13 | |
Glycine | Fisher brand | 12007-0050 | |
Heating pads | Kent scientific | DCT-20 | |
Heparin sodium salt | ACROS organics | 41121-0010 | 100mg/15ml of dH2O |
Humidified chamber | Invitrogen | 44040410 | A plastic box covered in foil can be used as an alternative humidified chamber. |
Insulin syringes | BD | 329461 | |
Inverted microscope | NIKON | Eclipse Ti-E2 | immunofluorescence |
KIM-1 antibody | R & D | AF1817 | RRID: AB_2116446 |
Lemozole (Histo-clear) | National diagnostics | HS-200 | |
lotus tetragonolobus lectin | Vector | FL-13212 | |
Microscope slide | Fisher scientific | 12-550-343 | |
Microtome | Reichert | Jung 820 II | |
monochrome CMOS camera | NIKON | DS-Qi-2 | |
Mouse surgical kit | Kent scientific | INSMOUSEKIT | |
NIS Elements | NIKON | ||
Objectives | NIKON | Plan Apo 20x/0.75 | image acquisition software linked to Eclipse Ti-E2 (invertd microscope) |
OCT compound | Scigen | 4586 | |
Pap pen | Vector | H-4000 | |
PBS with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
PBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
PDGF-D antibody | Thermo-Fisher scientific | 40-2100 | |
PFA | Electron Microscopy Science | 15710 | RRID: AB_2533455 |
Plate reader | Promega | GloMax® Discover Microplate Reader | 4% PFA is diluted from 16% in PBS. |
povidone-iodine (Betadine) | Avrio Health L.P. | NDC 67618-151-17 | |
Pressure cooker | Tristar 8 | Qt. Power Cooker Plus | |
ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
Quantichrom Urea (BUN) assay Kit II | BioAssay Systems | DUR2-100 | |
Single-edge razor blade for kidney dissection (.009", 0.23 mm) | IDL tools | 521013 | |
Slide warmer | Lab Scientific Inc., | XH-2001 | |
Software | NIKON | NIS elements | |
Sucrose | RPI | S24060 | |
TGF-b1 anitbody | Sigma-Aldrich | SAB4502954 | |
Tris EDTA buffer | Corning | 46-009-CM | RRID: AB_10747473 |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | SLBR6660V | |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | SLBR6660V | |
Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
White Glass Charged Microscope Slide, 25 x 75 mm Size, Ground Edges, Blue Frosted | Globe Scientific | 1358D |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon