Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para obter imagens e quantificar as mudanças na morfologia mitocondrial em vários tecidos. Na elegância C, a morfologia mitocondrial é frequentemente associada à sua funcionalidade. Mudanças na morfologia mitocondrial podem ser observadas sob várias condições de doença e com a progressão do envelhecimento, que muitas vezes se correlacionam com a desregulação da função mitocondrial, diferentes tecidos e ver elegância.
Exibem estruturas mitocondriais únicas que requerem estratégias de imagem distintas. Portanto, selecionar um microscópio apropriado e otimizar a preparação da amostra é essencial para o sucesso da imagem específica do tecido das mitocôndrias e C Elegance. Aqui, optamos por usar as cepas de cele transgênicas que expressam GFP localizada nas mitocôndrias em vez de corantes mitocondriais convencionais.
Isso nos permite evitar efeitos fora do alvo, penetrância bi onal e as complexas etapas de preparação de amostras necessárias para visualizar mitocôndrias em diferentes tecidos usando um corante. O foco principal do nosso laboratório é estudar a homeostase mitocondrial durante o estresse e o envelhecimento. A padronização de um protocolo de imagem mitocondrial é essencial para minimizar erros extramentais e gerar resultados reprodutíveis em relação a alterações na morfologia mitocondrial sob várias condições biológicas.
Para começar, obtenha lâminas de vidro limpas. Para a preparação da amostra, adicione 10 a 20 microlitros de solução de M nove na lâmina de vidro e coloque o número desejado de vermes adultos em idades específicas na solução. Na lâmina, cubra os vermes na solução M nove com uma lamínula para obter a imagem do músculo.
Mitocôndrias, cutuque a lamínula para rolar os vermes. Em seguida, com um esmalte, sele as laterais da lamínula para evitar a evaporação da solução M nine. Use um microscópio de campo amplo padrão para obter imagens de mitocôndrias musculares e epidérmicas que expressam as marcas fluorescentes.
Use um microscópio confocal para obter imagens de mitocôndrias intestinais e otimizar as configurações de imagem para se adequar à configuração experimental específica. Para iniciar a análise, abra o aplicativo Fiji após a instalação para baixar e instalar a macro do mapeador mito. Primeiro, baixe o código-fonte um.
Copie o código listado em Um código IJM para mapeador MIT 1.0. Abra Fiji e vá para plugins, seguido de new e macro cole o código copiado na janela de macro. Em seguida, salve a macro para uso futuro via arquivo e salve como.
Navegue até o arquivo e, em seguida, abra para abrir uma imagem microscópica 3D com Zs.In Fiji, crie uma projeção máxima sob a imagem, seguida por pilhas e projeto Z. Selecione o intervalo de fatias nas imagens em foco para projeção máxima e escolha intensidade máxima como o tipo de projeção para salvar a imagem máxima projetada. Como tiff, vá para o arquivo e clique em salvar seguido de tiff.
Corte as regiões de interesse da imagem completa com a ferramenta retângulo e navegue até a imagem e corte. Vá para o arquivo seguido de salvar como e tiff para salvar a imagem cortada no formato Tiff. Arraste e solte o mapa mito ou arquivo de macro salvo anteriormente na barra de ferramentas Fiji.
Clique em executar. Quando solicitado, selecione a pasta que contém o arquivo TIFF salvo na etapa anterior. Quando solicitado a selecionar uma área, crie um retângulo na imagem usando a ferramenta retângulo e pressione ok para confirmar.
Por fim, vá para o arquivo e salve os dados com todos os valores relacionados à morfologia mitocondrial como um arquivo CSV de pontos. A morfologia mitocondrial era específica do tecido, com mitocôndrias tubulares alinhadas com fibras musculares em músculos interconectados estruturas semelhantes a teias no intestino e mais arredondadas ou ovais. As mitocôndrias na imagem da hipoderme com um microscópio confocal melhoraram a visualização das mitocôndrias intestinais, reduzindo a luz fora de foco em comparação com a microscopia composta.
Nas lâminas, as mitocôndrias exibiram fragmentação após 30 minutos no tampão M nove, com as mitocôndrias epidérmicas mostrando a fragmentação mais proeminente. O envelhecimento resultou na fragmentação mitocondrial em todos os tecidos, aparecendo como estruturas truncadas e esféricas. A quantificação do mapeador do MIT indicou que o comprimento do objeto mudou nos músculos e o ponto de junção mudou na hipoderme.
