Desenvolvemos um método cromatográfico rápido que separa os componentes da reação IVT e pode ser usado para monitorar o consumo de NTP e a produção de mRNA. Com este método, podemos otimizar a reação IVT, maximizar o rendimento do mRNA e minimizar a formação de impurezas do processo e o custo da reação. Nossa metodologia foi pioneira no campo do mRNA, mostrando como o acoplamento de dados analíticos da reação IVT pode levar a maiores rendimentos e menores custos.
O campo agora está explorando outras ferramentas analíticas de processo em linha, como a espectroscopia Raman, mas a cromatografia ainda mantém um lugar fundamental devido ao seu poder de resolução e alta velocidade. Mostramos como capturar ferramentas analíticas de alto rendimento com o design de software de experimento para fazer uma otimização abrangente da reação IVT. Isso levou ao maior rendimento relatado de reação IVT de 25 gramas por litro.
Nosso método permite monitorar as concentrações de mRNA e NTP simultaneamente com tempos de leitura curtos, portanto, é adequado para monitoramento de IVT quase em tempo real. O campo de mRNA está agora se movendo em direção à fabricação contínua de mRNA e, é claro, estamos desenvolvendo ferramentas de próxima geração para apoiar essa transição. Para começar, descongele e pré-aqueça todos os reagentes, exceto enzimas, a 37 graus Celsius por 15 minutos em um bloco térmico ajustado a 300 rotações por minuto.
Marque cada tubo com uma transcrição in vitro designada ou número de IVT e ponto de tempo. Enquanto os reagentes estão descongelando, pipete dois microlitros de EDTA 100 milimolar em tubos estéreis de 0,5 mililitro. Agora remova as enzimas do freezer e guarde-as temporariamente em um refrigerador.
Prepare 50 a 100 microlitros da mistura de reação com volumes apropriados de reagentes IVT. Adicionar a RNA polimerase T7 como último reagente quando todos os reagentes IVT estiverem misturados. Remova imediatamente dois microlitros da mistura IVT e pipete-a em tubos de 0,5 mililitro previamente preparados contendo dois microlitros de EDTA.
Coloque os tubos de reação contendo misturas de IVT no bloco térmico e incube-os a 37 graus Celsius. Em cada ponto de tempo desejado, remova dois microlitros da amostra IVT da mistura de reação e pipete em tubos contendo EDTA. Depois que a análise cromatográfica confirmar a depleção completa dos NTPs, extinguir as reações de IVT em massa com EDTA até uma concentração final de 50 milimolares.
Para a reação IVT do lote Fed, misture os estoques de cada NTP e cloreto de magnésio. Depois de configurar a reação, quando a concentração de NTP cair abaixo de 10%, adicione um volume apropriado da ração à reação de IVT em massa. Uma vez alcançada a produção de mRNA desejada, inative toda a reação com EDTA até uma concentração final de 50 milimolares.
Para condicionamento de coluna, equilibre uma coluna analítica de 0,1 mililitro à temperatura ambiente por 12 horas antes da análise. Fixar a coluna ao sistema cromatográfico, seguindo a direcção indicada no compartimento da coluna. Em seguida, lave a coluna com 50 volumes de coluna de água bidestilada seguidos por 50 volumes de coluna de MPA a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto.
Em seguida, execute pelo menos três amostras em branco injetando apenas MPA antes da análise para estabelecer a linha de base. Agora prossiga para analisar a amostra de teste de adequação do sistema e as amostras da curva de calibração. Para o teste de adequação do sistema, combine os NTPs do reagente de capeamento, o molde de DNA do plasmídeo e o mRNA.
Agora crie o padrão de calibração usando a amostra de mRNA purificada diluída de concentração conhecida com fase móvel A. Se necessário, crie padrões com concentrações finais de NTP de 0,5, dois, cinco, 10, 15 e 20 micromolares para gerar a curva de calibração para todos os NTPs. Determine a diluição mínima necessária para amostras de IVT usando a fórmula. Antes de diluir para análise cromatográfica, vórtice e centrifugação para baixo a amostra IVT temperada.
Pipete o MPA e o cloreto de sódio em um frasco de vidro cônico e, em seguida, adicione a amostra de IVT temperada. Vortex a amostra preparada e carregue-a no amostrador automático, ajustado para quatro graus Celsius. Injetar 25 microlitros da amostra diluída na coluna analítica e medir a absorvância a 260 e 280 nanômetros para cada amostra de IVT.
Depois de concluir a análise de todas as amostras de IVT, injete novamente o padrão de teste de adequação do sistema para confirmar a estabilidade do sistema. A análise rápida em linha permite monitorar a produção de mRNA ao longo do tempo. Neste experimento, comparamos a influência da composição do tampão IVT na cinética do IVT.
A IVT realizada com o tampão A resultou na maior taxa de produção de mRNA, seguida pelo tampão B e tampão C. A reação de IVT também pode ser realizada como um Fed-Batch. O monitoramento do consumo de NTPs permite ajustar a concentração alimentando NTPs e cloreto de magnésio para a reação. Como as adições de ração diluem a reação de IVT, a concentração de mRNA na IVT cai a cada edição de alimentação.
