Nossa equipe se dedica ao desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas, terapias iPSC, para doenças de pele graves e atualmente incuráveis, como epidermólise bolhosa distrófica recessiva. Nosso objetivo é determinar se a edição precisa de genes, juntamente com a diferenciação do iPSC em células da pele, pode fornecer uma opção de tratamento viável para essas condições. A edição de genes em células somáticas e iPSCs usando a tecnologia CRISPR-Cas9 está transformando a medicina regenerativa, permitindo terapias personalizadas para várias doenças, incluindo doenças genéticas da pele.
Os desafios atuais na engenharia genética incluem efeitos fora do alvo dos editores de genes. A terapêutica requer editores de genes que corrijam com precisão o gene de interesse sem alterar nenhum outro local no genoma. Nosso desafio é demonstrar que os editores de genes não introduzem edições não intencionais além do gene alvo.
O protocolo CIRCLE-seq permite a identificação de locais potenciais fora do alvo genuínos que outras técnicas semelhantes podem perder. Uma análise abrangente desses locais fora do alvo fornece informações valiosas sobre a atividade dos editores de genoma, aumentando a segurança das terapias genéticas, incluindo nossa terapia baseada em IPSC para doenças de pele. Depois de cultivar células-tronco pluripotentes induzidas por cinco dias, colete as células por centrifugação e ressuspenda-as em 10 mililitros de PBS.
Misture seis microlitros de suspensão celular em seis microlitros de azul de tripano para contagem de células. Após a contagem, alíquota duas vezes 10 elevado a sete células por tubo. Centrifugar as células a 300 G durante três minutos a 25 graus Celsius e rejeitar o sobrenadante.
Prepare o ultrassônico focalizado direcionando o braço de controle. Encha o reservatório com água purificada e deionizada. No laptop da estação de controle, acesse o sistema hidráulico e clique em preencher para começar a encher o sistema.
Ajuste a temperatura para 4,5 graus Celsius. Transfira 25 microgramas de DNA genômico isolado de células-tronco pluripotentes induzidas para um microtubo. Encha o tubo até um volume total de 130 microlitros com tampão TE.
Defina as condições para cisalhar o DNA para um comprimento médio de 300 pares de bases, duração de 10 segundos, potência de pico de 70, porcentagem do fator de trabalho para 20 e ciclos de explosão para 50. Divida o DNA genômico cisalhado em duas porções de 65 microlitros cada. Purifique as amostras usando 1,8 vezes o volume de grânulos XP, seguido de separação magnética do rack.
Transferir o sobrenadante para uma nova placa de PCR e medir a quantidade de ADN utilizando um espectrofotómetro. Finalmente, execute um microlitro do DNA genômico de cisalhamento aludido em uma estação de fita. Para começar, ressuspenda oSQT1288 e o adaptador de grampo de cabelo para uma concentração final de 100 micromolares em tampão TE.
Para o recozimento do adaptador, misture 40 microlitros de oSQT1288, 10 microlitros de 10X STE e 50 microlitros de água livre de nuclease para atingir um volume total de 100 microlitros. Após o recozimento do adaptador, misture 10 microlitros de tampão de ligação 5X, cinco microlitros de DNA ligase e cinco microlitros de adaptador de grampo de cabelo recozido, pipete 20 microlitros da mistura mestre de ligação do adaptador em cada amostra de DNA eluída contendo contas. Coloque as amostras em um termociclador a 20 graus Celsius por uma hora e, em seguida, mantenha a quatro graus Celsius indefinidamente.
Em seguida, transfira 50 microlitros de solução de pulverização de PEG / NaCl para o DNA ligado ao adaptador. Purifique as amostras usando grânulos XP e separação magnética de rack. Eluir as amostras com 30 microlitros de tampão TE pH oito e decantar os sobrenadantes para uma nova placa de PCR semi-contornada.
Combine as amostras e quantifique o DNA usando o ensaio dsDNA BR. Para preparar o master mix de circularização, combine oito microlitros de água livre de nuclease, 10 microlitros de tampão DNA ligase 10X TD4 e dois microlitros de DNA ligase T4 para um volume total de 20 microlitros. Pipete 20 microlitros da mistura mestre de circularização para 80 microlitros de 500 nanogramas de DNA tratados com o usuário PNK.
Incubar a amostra em um termociclador a 16 graus Celsius por 16 horas. No dia seguinte, adicione 100 microlitros de grânulos XP ao DNA circularizado e purifique as amostras, conforme demonstrado anteriormente. Eluir a amostra com 38 microlitros de tampão TE e transvasar o sobrenadante para uma nova placa PCR semi-contornada.
Para clivar o DNA genômico circularizado purificado, prepare a mistura mestre de clivagem in vitro combinando cinco microlitros de tampão 10X Cas9, 4,5 microlitros de Streptococcus pyogenes Cas9 e 1,5 microlitros de RNA genômico para um volume total de 11 microlitros. Incube a mistura principal de clivagem em temperatura ambiente por 10 minutos. para formar os complexos RNP de gRNA Cas9.
Diluir 125 nanogramas de DNA genômico tratado com DNase seguro para plasmídeo até um volume final de 39 microlitros em água livre de nuclease. Em seguida, adicione 11 microlitros da mistura principal de clivagem aos 39 microlitros de DNA para um volume total de 50 microlitros. Incube a mistura em um termociclador por uma hora a 37 graus Celsius e mantenha-a a quatro graus Celsius indefinidamente.
Após a incubação, adicione 50 microlitros de grânulos XP ao DNA clivado in vitro e purifique o DNA em um rack magnético. Eluir o DNA purificado em 42 microlitros de tampão TE. Para a análise de dados de sequenciamento de próxima geração, instale o Python versão 2.7, o Burrows-Wheeler Aligner e o SAMtools.
Baixe o genoma de referência do site fornecido. Defina o arquivo FASTA do genoma de referência, o diretório de saída para a análise e os caminhos para os comandos BWA e SAMtools. Especifique as sequências de destino e os caminhos para os arquivos FASTQ demultiplexados para as amostras clivadas por nuclease e controle.
Execute a análise baseada em referência padrão usando o comando a seguir. Ao executar o pipeline completo, localize os resultados de saída de cada etapa em uma pasta de saída distinta designada para essa etapa específica.
