O objetivo desta pesquisa é aprofundar nossa compreensão do papel da vasculatura pancreática na biologia pancreática normal e no desenvolvimento da doença. Ao enriquecer com sucesso a fração endotelial, procuramos identificar vias específicas dentro da vasculatura que governam as funções pancreáticas, que podem ser potencialmente direcionadas para restaurar e melhorar as funções pancreáticas em contextos de doenças. Recentemente, uma ênfase crescente tem sido colocada no papel da disfunção das células endoteliais nas patologias pancreáticas.
A identificação da heterogeneidade das populações de células endoteliais no pâncreas permitiu a compreensão de como as interações endoteliais do pâncreas se esforçam ou protegem contra doenças. Abordagens ômicas, como sequenciamento de RNA de célula única ou núcleo único, proteômica e genômica, estão sendo usadas para estudar o pâncreas em nível celular. Para obter insights no nível tecidual ou espacial, novas plataformas usando abordagens imparciais e baseadas em sondagem, como Visium e Xenium, estão sendo implementadas.
Neste protocolo, descrevemos uma técnica de dissociação suave que minimiza as enzimas pancreáticas endógenas de diminuir a viabilidade celular e um procedimento de classificação magnética de células para enriquecer seletivamente as células endoteliais. A estratégia de dissociação e enriquecimento de nosso protocolo permitirá uma compreensão mais aprofundada dos marcadores de superfície celular e do transcriptoma das células endoteliais pancreáticas que antes eram pouco explorados devido a limitações técnicas. Para começar, posicione o mouse sacrificado na mesa de operação.
Estique os membros do mouse e prenda-os com alfinetes. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma pequena incisão na linha média através da pele e do peritônio da região abdominal inferior e estenda em direção à região torácica. Corte o diafragma e levante a caixa torácica para expor o coração.
Insira uma agulha de calibre 25 a 30 conectada a uma seringa contendo PBS estéril gelado no ventrículo esquerdo do coração. Perfunda o coração a uma taxa de cinco a 10 mililitros por minuto e pare após injetar 10 mililitros. Em seguida, usando tesouras de dissecação e pinças, extraia o pâncreas com cuidado.
Transfira o pâncreas para um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de PBS gelado, junto com o inibidor de tripsina e coloque o tubo no gelo. Para começar, obtenha o pâncreas murino em uma placa de Petri contendo PBS gelado. Usando tesouras cirúrgicas e pinças, remova cuidadosamente o excesso de tecido.
Transfira o pâncreas aparado para um tubo de cinco mililitros contendo um mililitro de solução de dissociação. Com uma tesoura de dissecação, pique os tecidos pancreáticos em pedaços finos, mantendo o tubo no gelo. Transferir o lisado para um tubo de 50 mililitros colocado sobre gelo.
Adicione dois mililitros de solução de colagenase ao tubo de cinco mililitros para remover qualquer tecido pancreático residual e transfira-o para o tubo de 50 mililitros. Incube o tubo em banho-maria temperado a 37 graus Celsius por 20 minutos. Coloque o tubo com homogeneizado de tecido no gelo e deixe-o assentar por gravidade.
Em seguida, passe o sobrenadante por um filtro de 70 micrômetros e adicione cinco mililitros de solução de parada de dissociação. Utilizando uma agulha de calibre 27, triturar o grânulo restante com mais um mililitro de solução de dissociação e passá-lo através do filtro como antes. Girar a suspensão celular a 300 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e ressuspender o pellet num mililitro de tampão de lavagem.
Incube uma vez 10 elevado a sete células com um microlitro de anticorpo anti-biotina CD31 em um rotador. Adicione 20 microlitros de MicroBeads anti-biotina e incube por mais 40 minutos. Em seguida, monte um suporte magnético com o suporte do separador de coluna e aplique a coluna.
Depois de equilibrar a coluna, adicione a amostra e lave com um total de nove mililitros de tampão de lavagem. Retire a coluna do suporte e coloque-a em um tubo de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de tampão de lavagem à coluna.
Usando um êmbolo, empurre para baixo as células na coluna para coletar a eluição contendo as células endoteliais. Finalmente, diminua as frações de fluxo e eluição. Após a ressuspensão, conte as células e meça a viabilidade.
A análise quantitativa de PCR para validar o enriquecimento de células endoteliais mostrou que as frações enriquecidas apresentaram níveis significativamente mais altos de genes marcadores, Pecam1 e Kdr em comparação com as amostras de fluxo. Um nível mais baixo de NK6 homeobox 1, um fator de transcrição nas células endócrinas pancreáticas, foi observado nas frações enriquecidas. O Western blotting mostrou fortes sinais de CD31 no tamanho esperado, confirmando ainda mais o enriquecimento das células endoteliais nas frações.
