As moscas-sopradoras são um grupo diversificado de moscas que podem ser parasitas obrigatórios ou facultativos, bem como sapro-necrófagos. As espécies parasitas obrigatórias alimentam-se exclusivamente de tecidos vivos e causam miíase em vertebrados, enquanto as espécies sapro-necrófagas alimentam-se de matéria orgânica em decomposição. Os parasitas facultativos podem se alimentar de material vivo ou em decomposição e viver como parasitas ou não.
Embora a fase larval seja a mais problemática, a fêmea desempenha um papel decisivo, pois escolhe onde ovipositar e, portanto, controla amplamente onde as larvas se alimentarão e se desenvolverão. O objetivo geral dos métodos aqui apresentados é avaliar tanto a preferência do substrato alimentar larval quanto a escolha do local de oviposição das fêmeas em moscas-varejeiras. Preferência alimentar larval.
Primeiro passo, preparação das placas de Petri com ágar 2%Prepare placas de Petri com 2% de ágar. Para fazer isso, adicione seis gramas de ágar bacteriológico a 300 mililitros de água e derreta essa mistura em um micro-ondas. Em seguida, divida o volume em quatro placas de Petri.
Prepare o número de placas de Petri com ágar de acordo com o número de réplicas desejadas. Depois que o ágar estiver solidificado, faça quatro furos no ágar usando o petter de corte fornecido em nosso papel em um tubo cônico de 50 mililitros com três centímetros de diâmetro, dois furos de cada lado da placa de Petri. Segunda etapa, preparação dos substratos.
Para preparar a carne fresca com sangue, use 12 mililitros de sangue bovino diluído, que é metade sangue com uma solução anticoagulante e metade água filtrada. Em seguida, adicione esta solução a 200 gramas de carne moída bovina fresca e mexa bem. Lembre-se de usar cilindros e colheres diferentes para cada tipo de carne para evitar outras contaminações entre substratos.
Para preparar o substrato podre, adicione 12 mililitros de água filtrada a 200 gramas de carne podre e mexa-a como foi feito com a carne fresca. Antes do início do experimento, a carne é deixada para apodrecer por cinco dias a 25 graus Celsius em uma incubadora. Depois de preparar o substrato de carne, preencha os orifícios no ágar com carne fresca e podre de cada lado.
Lembre-se de aleatorizar a posição da carne nas placas de Petri como estamos mostrando aqui. Terceira etapa, montagem experimental. Em uma sala a 25 graus Celsius, ajuste a almofada de aquecimento logo abaixo de uma fonte de luz para iluminar uniformemente o ensaio de preferência em um amplo viés de comportamento em direção ou contra a luz.
Em seguida, use papelão ao redor da almofada de aquecimento como suporte para manter todos no mesmo nível. Coloque um papelão preto sobre todo o conjunto, a almofada de aquecimento, mais o papelão de apoio, para manter o mesmo padrão de cor acima de todos os substratos. Coloque seis placas de Petri com ágar e substrato de carne sobre o papelão preto com dois substratos, um de cada tipo na almofada de aquecimento e os outros dois fora da superfície da almofada de aquecimento.
Fazendo isso, vamos permitir que cada uma das placas de Petri tenha quatro substratos, fresco e frio, podre e frio, fresco e quente e, finalmente, podre e quente. Deixe o substrato aquecer por cerca de 10 minutos. Quarto passo, teste larval.
Verifique a temperatura do substrato com um termômetro infravermelho. O lado mais frio deve ficar em torno de 25 graus Celsius e o mais quente em torno de 33 graus Celsius. Após atingir a temperatura desejada, coloque cinco larvas de terceiro ínstar no centro de cada placa de Petri usando um tweezer.
Em seguida, cubra a placa de Petri com a tampa e deixe o experimento de escolha correr por exatos 10 minutos. Durante o experimento, as larvas vão rastejar ao redor da placa de Petri e escolher entre as quatro opções. Se alguma larva escapar, leve-a usando um tweezer, e coloque-a de volta ao centro da placa de Petri.
Após 10 minutos, tire todas as placas de Petri da almofada de aquecimento e coloque-as em uma superfície diferente. Em seguida, conte quantas larvas existem em cada substrato. Observamos que larvas coloridas permanecem no substrato escolhido.
Preferência do local de oviposição das fêmeas. Primeiro passo, montagem experimental. A tarefa pode ser feita em uma prateleira comum que antes era coberta com papelão preto.
Esses cartões, assim como em um ensaio larval, são necessários, então nenhuma pista visual está disponível para as fêmeas adultas. A prateleira também precisa ser revestida uniformemente com fitas de LED. Em uma sala a 25 graus Celsius, coloque a almofada de aquecimento no centro da prateleira.
Use papelão ao redor da almofada de aquecimento como suporte para manter todos no mesmo nível. Coloque um papelão preto sobre todo o conjunto, uma almofada de aquecimento, além de papelão de apoio para manter o mesmo padrão de cor acima de todos os substratos. Posicione as almofadas de aquecimento sob dois braços da mesma cruz entre duas cruzes diferentes.
Isso permitirá um melhor aproveitamento do espaço na prateleira. Acenda as luzes LED e a almofada de aquecimento antes do início do experimento. Lembre-se de sempre limpar os vidros em forma de cruz com etanol 70% para evitar contaminação de odor entre os testes.
Segunda etapa, preparação dos substratos. Prepare as placas de Petri de plástico com cinco gramas de carne fresca ou podre. O substrato é o mesmo da larva, fresca e apodrecida com cinco dias de idade.
Um total de quatro pratos de Petri são necessários para cada cruz, dois com carne fresca e dois com carne podre. Para a carne fresca, adicione um milímetro de sangue bovino diluído, que é metade do sangue com anticoagulante e metade de água. Para a carne podre, adicione um milímetro de água filtrada.
Lembre-se de mexer bem os dois substratos e usar colheres diferentes para evitar a contaminação cruzada de odores entre carne podre e fresca. Verifique se o álcool evaporou completamente nas cruzes. Em seguida, coloque quatro placas de Petri com carne na extremidade dos braços das cruzes, uma de cada tipo de carne na almofada de aquecimento e as outras duas fora da superfície da almofada de aquecimento.
Isso permitirá que cada uma das cruzes tenha quatro substratos, fresco e frio, podre e frio, fresco e quente e, finalmente, podre e quente. Feche a abertura das cruzes e deixe os substratos aquecerem por cerca de 10 minutos. Terceiro passo, teste feminino.
Colecione agarre uma fêmea na gaiola de mosca. Eles são caracterizados por ter um abdômen amarelo aumentado e esbranquiçado. Separe uma fêmea para cada cruz em tubos individuais.
Verifique a temperatura dos substratos com um termômetro infravermelho. O lado mais frio deve ficar em torno de 25 graus Celsius e o mais quente em torno de 33 graus Celsius. Coloque um tubo com uma fêmea agarrada bem na abertura central de cada cruz.
Depois que a fêmea entrar na cruz, feche a abertura com a tampa. Depois de colocar todas as fêmeas em cada cruz, feche a parte aberta da prateleira com o papelão preto para proteger contra fontes de luz externas. Deixe o experimento durar exatamente quatro horas.
Após este tempo, retire a fêmea das cruzes usando um tubo. Em seguida, verifique se havia alguma outra posição no substrato. Identifique a tampa de cada placa de Petri com o nome do substrato.
Use etanol 70% para limpar as cruzes de qualquer odor do teste. Passo quatro, contagem de ovos. As placas de Petri podem ser congeladas antes da contagem.
Neste caso, descongele as placas de Petri. Em seguida, conte o número de ovos em cada substrato usando um estereomicroscópio. Análise de dados e estatísticas.
Primeiro passo, cálculo do índice de preferência. Para cada réplica dos testes comportamentais, um índice de preferência é calculado separadamente para o tipo de substrato e para a temperatura. O índice de preferência por tipo de substrato é representado pelo número de larvas ou ovos nos substratos de carne fresca dividido pelo número total de larvas ou ovos em todos os substratos.
O índice de preferência por temperatura é representado pelo número de larvas ou ovos em substratos quentes dividido pelo número total de larvas ou ovos em todos os substratos. Considerando ambas as preferências de índice, valores próximos a um refletem a preferência por substratos frescos ou quentes. E valores próximos de zero significam a preferência por substratos podres ou frios.
Segundo passo, comparação da preferência observada com a escolha aleatória. Podemos visualizar o índice de preferência pela temperatura no eixo Y e o índice de preferência pela carne no eixo X. Para determinar se as larvas e/ou fêmeas exibem preferência por uma condição, comparamos nossos resultados com uma escolha aleatória usando dados simulados.
Nossos resultados de larvas diferiram significativamente de todos os conjuntos de dados simulados em termos de temperatura e preferência de carne. Graficamente, é evidente que as larvas exibiram uma forte preferência pelo substrato podre e frio. Verificou-se que a preferência feminina por um tipo de carne foi significativamente diferente de uma escolha aleatória em cerca de 30% das comparações.
Para a temperatura, cerca de 70% das nossas comparações resultaram em uma preferência significativa. Ambos os protocolos oferecem a possibilidade de testar a preferência de larvas e fêmeas por dois fatores que interagem, tipo de carne e temperatura. Os testes são simples e podem ser adaptados para testar a preferência de outras espécies do mesmo tamanho e ou outras condições.
Sabemos que o comportamento dos animais é bastante variável e influenciado por diversos fatores ambientais, por isso cuidados especiais devem ser tomados para evitar iluminação desigual, cheiros persistentes e outras contaminações do substrato por meio de utensílios compartilhados. Obrigado por assistir.
