Este protocolo é significativo porque simplifica e permite medições de radiância em materiais espessos, permitindo-nos reunir informações importantes ao estudar sistemas vivos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite medições espectrais espacialmente resolvidas em materiais altamente absorventes usando equipamentos que podem ser construídos e experimentos que podem ser executados em laboratórios de campo. Este método pode ser adaptado e aplicado a qualquer sistema vivo.
A técnica de fazer as sondas tem nuances, mas a prática leva à perfeição. Ajuste a técnica de medição dependendo do material que está sendo sondado e faça alterações que resultem em uma posição mais segura do tecido e menor atrito da sonda. Para começar, construa a manga de vidro com uma pipeta Pasteur de 5,75 polegadas.
Usando um grampo de jacaré montável, monte a pipeta de vidro pela extremidade larga de modo que a extremidade cônica fique voltada para baixo em direção ao chão e a orientação da pipeta seja perpendicular ao chão. Coloque uma almofada de fita elétrica em um punho de plástico de 50 gramas para ajudar a evitar deslizamentos e pendure o punho da extremidade cônica da pipeta. Usando uma pequena tocha de butano, aqueça a extremidade cônica da pipeta conforme descrito no manuscrito.
Quando o comprimento da pipeta tiver aumentado em cerca de cinco polegadas, remova imediatamente a chama. Em seguida, use uma tesoura pequena ou um cortador de vidro para aparar a extremidade puxada da pipeta. Arquive quaisquer áreas pontiagudas da extremidade aparada usando papel carborundum e enxágue quaisquer pequenos cacos de vidro ou poeira usando álcool isopropílico seguido de ar comprimido.
Use uma lâmina de barbear para cortar a fibra óptica e remover um conector SMA de uma fibra óptica terminada em SMA. Certifique-se de cortar perto de uma das terminações SMA. Em seguida, remova os cinco centímetros seguintes de plástico e revestimento de fibra de vidro para que a fibra óptica nua fique exposta e se projete do resto de todo o conjunto.
Use a tocha de butano para queimar o revestimento de polímero de poliamida da fibra de vidro. Enxágue com isopropanol e limpe a fibra de vidro nua usando um lenço sem fiapos. Agora, monte a extremidade nua da fibra óptica diretamente em um alicate em uma borda de mesa ou prateleira, deixando a extremidade da fibra terminada em SMA pendurada em direção ao chão.
Cerca de quatro a seis centímetros de onde a fibra óptica nua é mantida na braçadeira do alicate, adicione os pesos para puxar usando duas pequenas braçadeiras na extremidade encamisada da fibra. Para puxar a fibra, comece com a chama da tocha de butano acesa. Segure a tocha de butano a um centímetro da fibra nua, conforme descrito no manuscrito.
E deixe a fibra esticar, puxar, separar e cair no chão. Verifique a fibra sob o microscópio e corte a extremidade da fibra com uma pequena tesoura de dissecção, se necessário. Use uma caneta de espuma opaca para escurecer as laterais da fibra e evitar a entrada de luz dispersa.
Puxe suavemente a ponta da caneta através da fibra, deixando apenas uma pequena área na ponta descoberta. Sob um microscópio estéreo, insira cuidadosamente a fibra óptica cônica na extremidade larga da pipeta de vidro alterada e empurre a fibra até que aproximadamente um milímetro de fibra nua esteja saindo da extremidade cônica da pipeta. Usando fita elétrica, prenda a extremidade encamisada da fibra óptica à extremidade larga da pipeta.
Coloque uma gota de adesivo de cianoacrilato em uma agulha de calibre pequeno. Toque cuidadosamente a gota de adesivo na borda cortada da pipeta puxada, evitando a extremidade nua da fibra puxada. Para modificar a ponta da fibra com uma esfera de espalhamento, crie a matéria-prima misturando uma gota de adesivo curável UV com pó de dióxido de titânio em uma proporção igual.
Conecte a sonda a um micromanipulador com um suporte de haste de montagem de tal forma que a sonda esteja em uma orientação horizontal. Prepare um reservatório de trabalho do material de espalhamento mergulhando a ponta de um fio ou agulha na mistura preparada, de modo que uma gota de adesivo se forme. Monte o fio ou agulha com a gota perto da ponta da sonda horizontal.
Deposite uma esfera de espalhamento na ponta da sonda. Use o micromanipulador para empurrar a ponta da fibra óptica da sonda lenta e cuidadosamente para dentro da mistura preparada. Em seguida, retirava rapidamente a ponta da cola e visualizava a bola espalhada em um microscópio.
Repita até que uma gota esférica de adesivo do tamanho desejado seja depositada na ponta da fibra óptica. Prepare os pratos para montar as amostras. Usando uma tocha de butano, aqueça a extremidade grande de uma pipeta de Pasteur para derreter um buraco de 0,5 centímetro de diâmetro no fundo de uma placa de Petri de plástico.
Sele o orifício no lado inferior do prato com fita elétrica ou fita adesiva. Em seguida, encha uma placa de Petri um quarto do caminho e uma segunda placa de Petri com a gelatina líquida e deixe esfriar até a temperatura ambiente logo após a gelificação. Em um prato, coloque a biópsia na almofada de gelatina viscosa que se formou no buraco no fundo do prato.
Usando uma pipeta de Pasteur, adicione suavemente gelatina à temperatura ambiente ao redor da biópsia até que a placa de Petri esteja cheia. Para a amostra em branco, use o prato recheado apenas com gelatina. Conecte a sonda a um suporte orientado verticalmente de modo que ele aponte para a fonte de luz e prenda a sonda com grampos, grampos de mangueira ou fita adesiva a um poste de mesa óptico.
Conecte a extremidade da fibra óptica da sonda terminada por SMA a um espectrômetro de fibra óptica USB e conecte o espectrômetro ao computador usando um cabo USB. Mantenha a sonda e os manipuladores na posição exata alinhada onde os dados serão coletados. Use um cotonete, agulha de calibre fino ou conta-gotas para aplicar cuidadosamente uma pequena quantidade de lubrificante de silicone na parte da sonda que será inserida no tecido para diminuir o atrito entre os lados da sonda e a amostra de tecido.
Agora, remova a fita que cobre o orifício na placa de Petri da amostra e coloque-a no suporte da amostra, garantindo que ela seja mantida firmemente no lugar por atrito. Use o micromanipulador para abaixar a amostra na sonda e permitir que a sonda entre na gelatina através do orifício na parte inferior da placa de Petri. Continue até que a sonda esteja a aproximadamente cinco milímetros do fundo da camada de gelatina.
Ligue a fonte de luz. Usando o software do espectrômetro, ajuste o tempo de integração do espectrômetro até que o sinal seja o mais alto possível, mas não saturando. Defina o número de varreduras médias entre dois e cinco e o valor dos pixels de suavização como seis.
Os tempos de integração utilizáveis neste estágio podem variar de um a 15 milissegundos para essa linha de base. Verifique se o tempo de integração é apropriado para a medição, garantindo que o espectro não seja nem muito barulhento nem saturado. Altere o tempo de integração, se necessário.
Mova a amostra por uma distância especificada usando o micromanipulador e execute as medições. Continue a salvar os espectros em cada posição vertical dentro do tecido. A aparência microscópica da sonda que sobe através do tecido é visualizada.
A porcentagem de luz em diferentes profundidades de tecido em relação à linha de base é mostrada. A coisa mais importante a lembrar é que essas sondas são frágeis, então tome seu tempo e certifique-se de que as junções da sonda estejam seguras antes de prosseguir. Após a confecção da sonda, as técnicas de medição podem ser adaptadas.
Por exemplo, sem a esfera de espalhamento, sondas podem ser usadas para medir a radiância que atinge o detector a partir de uma única direção. Depois de desenvolver essa sonda, os pesquisadores foram capazes de medir a luz dentro do cérebro e do tecido adiposo em camundongos usando uma variação em nosso aparelho de medição. Isso ajudou a responder à questão de se havia luz suficiente para ativar os fotorreceptores presentes profundamente no tecido.
