מחקר העיניים בזמנים קדומים הסתמך בעיקר על רקמת העין של אנשים שנפטרו. עם זאת, במהלך השנים פותחו מודלים רבים של מכרסמים אופתלמיים והצורך ברקמת עין אנושית פחת. בשל גודלו הקטן ושטח הפעילות המצומצם בעין המכרסם, הגישה היעילה לחלקי העין מוגבלת מאוד.
בדרך כלל, כדי לנתח עין של מכרסם, העין משותקת דרך עצב הראייה והדיסקציה מבוצעת. תרגול זה הוא מפרך ועלול לפגוע ברקמה השברירית כאשר העין הכדורית ממשיכה לנוע במהלך הדיסקציה. למרות היותה מועילה בבידוד החלקים השונים של שכבות הרשתית, טכניקה זו אינה יכולה לתחום את הכיוון המרחבי של הרקמה בעת נתיחת הרקמה.
יתר על כן, התערבות ממוקדת קשה לאתר לאחר דיסקציה בשל הרכבה תאית הומוגנית של העין האחורית והקדמית. בסרטון זה מודגמת שיטה כירורגית שונה למיקרודיסקציה. הימצאותו של קרום הניקוט המצורף, או העפעף השלישי, מציגה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים.
בשיטה זו, תחילה גלגל העין הוא enucleated עם העפעף השלישי, ולאחר מכן העפעף השלישי משמש כדי לשתק את העין. זה ואחריו פירסינג גלגל העין דרך לימבוס הקרנית, ואת החתך משמש כנקודת הכניסה. לאחר מכן, על ידי חיתוך לאורך ההיקף, כוסות העין הקדמית והאחורית מופרדות.
על ידי ניתוח נוסף של העין האחורית, השכבה השקופה של הרשתית העצבית מזוהה ומקולפת בעדינות. השכבות העצביות וה-RPE מתקבלות אפוא לעיבוד נוסף. העפעף השלישי יאפשר לנו לתחום את הכיוון המרחבי של עמוד העין.
הבה נעקוב כעת אחר הליך מפורט שלב אחר שלב. להרחיב את העיניים מכרסם באמצעות טיפה של 0.8% tropicamide ו 5% phenylephrine פתרונות אופתלמיים ומניחים את החיה באזור כהה במשך 30 דקות לפני ההליך. להרדים את החיה על ידי מתן תוך צפקי חמש פעמים מנות של הרדמה.
מינון טיפוסי הוא 200 מיקרוליטר PBS המכיל 10 מ"ג קטמין ואחד מ"ג קסילזין. אשר חוסר תגובה מוחלט לגירוי על ידי בחינת רפלקס הדוושה. הניחו את העכבר בשכיבה צידית כדי לאפשר גישה מלאה לעין.
שמור על מלקחיים לתפירת קוליברי, מלקחיים מעוקלים, מיקרו-להב בגודל 15 מעלות שלושה מילימטר, מיקרו-מספריים קפיציים ומיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים מוכנים להליך. מניחים מלקחיים מעוקלים סביב גלגל העין וצובטים כדי לשחרר את העין מחיבורים חיצוניים. העפעף השלישי, הידוע גם בשם הממברנה הניקטיבית, ממוקם לכיוון הפינה העליונה של משיק האף וניתן לזהותו כבליטה שקופה מינורית עם גבולות פיגמנטיים.
לאחר מכן, להשתמש מיקרו מספריים קפיץ לחתוך סביב גלגל העין. חתכים קטנים ומתמשכים משחררים את גלגל העין מחיבורים סקלרליים. מניחים מיקרו-מספריים קפיציים מעוקלים מתחת לגלגל העין כדי לשחרר את העין על ידי חיתוך עצב הראייה.
הניחו את העין המוחדרת בצלוחית פטרי המכילה חיץ PBS כך שגלגל העין יהיה שקוע ב-PBS. חלק מהשרירים או הרקמות החוץ-עיניות יתחילו לצוף הרחק מגלגל העין. הסר אותם על ידי חיתוך אותם גלגל העין באמצעות מיקרו מספריים קפיץ.
לאחר מכן, הסר את עצב הראייה מבסיס גלגל העין כדי לאפשר הפרדה טובה יותר של הרשתית עבור ההכנות wholemount. אין צורך להסיר את עצב הראייה עבור חתך רקמות. מעבירים את גלגל העין לצינורית של 1.5 מ"ל המכילה מ"ל אחד של 4% פאראפורמלדהיד או PFA.
שמור אותו במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס לקיבוע רקמות. ניתן לעצור בשלב זה על ידי השארת הרקמה ב- PFA עד 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס. עם זאת, עבור בידוד של תאים חיים, שלבי הקיבוע לא צריך להתבצע ואת ההליך כולו צריך להתבצע ברצף.
לאחר קיבוע PFA, העבירו את גלגל העין לצלחת פטרי המכילה PBS והניחו אותו תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לבצע את ההליך הבא. לשתק את גלגל העין על ידי החזקת העפעף השלישי בחוזקה עם מלקחיים תופרים קוליברי. הלימבוס הוא צומת סקלרל הקרנית.
בצע חתך קטן בלימבוס על ידי פירסינג באמצעות מיקרולהב. החתך נעשה רצוי מול העפעף השלישי. לאחר מכן, באמצעות חתך זה כנקודת התחלה, עם מספריים מיקרו לבצע חתכים קטנים ומתמשכים לאורך היקף זה לימבוס סקלרלי הקרנית.
ראשית, השלימו חצי עיגול של חתכים החל מנקודת החתך ועד לעפעף השלישי. לאחר מכן השלימו את חצי העיגול הנותר של החתכים בצד השני. לבסוף, בצע חתך סביב העפעף השלישי כדי להפריד בין הגביע האחורי והקדמי.
הסר את העדשה מהגביע האחורי באמצעות מלקחיים כדי לקבל את הגביע האחורי המורכב מהרשתית העצבית ושכבת RPE ואת הגביע הקדמי של הקרנית. אם עובדים עם רקמות לא מקובעות, ניתן כעת לעכל אנזימטית את הגביעים הקדמיים והאחוריים כדי לקבל תרחיף חד תאי בקרנית או ברשתית. לקיבוע הרקמות, העבירו כוסות אלה לצינור של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% PFA למשך 12 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הקיבוע, ניתן להטביע את הרקמה במדיום המתאים וניתן לבצע קריוסקציה או חתך פרפין כדי להשיג חתכים בקרנית או ברשתית. הכניסו מחדש את הכוס האחורית לצלחת הפטרי המכילה חיץ PBS. שכבה אטומה על שכבת RPE פיגמנטית היא הרשתית העצבית.
יש לקלף את הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים שנייה. תנועה עדינה וקלה מאוד של היד מומלצת מאוד כדי לא לפגוע ברקמה. בעצב הראייה, יציאה, ניתן להחדיר את מספריים הקפיץ המעוקלים מתחת לרשתית העצבית, וניתן לבצע חתך כדי לשחרר לחלוטין את השכבות אם הרשתית העצבית נשארת מחוברת.
ניתן גם לשחרר או לנתק את הרשתית על ידי ליטוף עדין עם מברשת רכה. הכניסו מחדש את הכוסות הקדמיות והאחוריות לצלחת פטרי המכילה חיץ PBS. השתמש במיקרו-מספריים קפיציים זוויתיים כדי לבצע חתך ליד העפעף השלישי מהפריפריה בניצב לכיוון מרכז הראייה.
שמרו על אחיזה בעפעף השלישי ובצעו חתך ליד החתך הראשון. בצע חתך דומה בין החתך השני לעפעף השלישי. שלושה או ארבעה חתכים כאלה במרחקים שווים פותחים את הגביעים החצי ספריים לצורת פרח, שנופלת שטוחה וניתנת להרכבה בקלות.
אין לבצע חתכים עמוקים מאוד עד למרכז הכוס, שכן זה עלול לגרום לחלקי העלה להתפרק או להיפרד בקלות. התווך הנוזלי מאפשר לגביע העין הקדמי להשיג מבנה מעוקל. בצע את אותם השלבים שניתנו לביצוע חתכים על הכוס האחורית כדי לבצע שלושה או ארבעה חתכים במרחק שווה על הכוס הקדמית.
הרקמות מוכנות כעת להכתמה נוספת. באיור זה, wholemount של קדמית מוצג. רקמת הקרנית עברה מיקרודיסקציה כמתואר כדי לחשוף את כלי הלימפה ברקמת הלחמית המחוברת של עלון הקרנית.
באיור זה, wholemount של הרשתית העצבית מוצג. כלי הדם ברשתית של הרשתית העצבית הוכתמו באיזולקטין ונראים ככלי דם ירוקים. בשיטה זו, גלגל העין של העכברים מתקבל עם העפעף השלישי המחובר לטיפול יעיל וקל.
העפעף השלישי משתק את גלגל העין לחלוטין ומאפשר לדיסקציה להתקדם בקלות ובמינימום טעויות. שיטה זו מועילה עבור חתך ספציפי לרקמת העין, אנליזה של תא בודד וסיטונים. עם זאת, הצורך בקיבוע רקמה חוזר הופך את הרקמה לבלתי בת קיימא עבור תרבית תאים או צרכים כאלה של תאים חיים.
לפיכך, יש לבצע את ההליך ברצף לבידוד תאים חיים.
