Determinar a localização subcelular de uma proteína é fundamental para delinear sua função adequada e os mecanismos envolvidos nela. Este método pode nos ajudar a visualizar a localização subcelular de uma proteína no nível da ultraestrutura. A imunomarcação mediada por pontos quânticos é mais estável, resistente ao fotobranqueamento, tem seus próprios espectros de emissão, produz alta densidade de elétrons e exibe maior eficiência e retenção em tecidos com melhor penetração nos tecidos.
Várias etapas do processo, ou seja, fixação, gravação, bloqueio e concentração ideal de pontos quânticos, são etapas desafiadoras para otimizar. É aconselhável tentar vários pontos de tempo e concentrações dos reagentes utilizados. Outro desafio é lidar com grades para as quais apenas a paciência e, claro, a prática funcionam.
Demonstrando o procedimento estarão Chowdhury Abdullah, um bolsista postal, Naznin Remex, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, e Brandon Hartman, supervisor de microscopia eletrônica de nossos serviços de microscopia eletrônica. Depois de anestesiar os camundongos e abrir a cavidade torácica, profundir o coração usando glutaraldeído gelado a 3% em tampão de cacodilato de sódio a 0,1 molar por dois minutos. Use uma agulha de calibre 25 de cinco por oito polegadas para introduzir os fixadores no coração usando a pressão da gravidade.
Imediatamente após o coração começar a se encher com o fixador, levante o ápice do coração para aliviar a pressão. Corte os vasos por baixo a um a dois milímetros do coração e permita que os líquidos drenem. Dissecar o coração.
Remova os átrios e solte os ventrículos em uma placa de Petri contendo 3% de glutaraldeído gelado e cacodilato de sódio 0,1 molar. Faça um corte de borboleta após 30 a 60 minutos de fixação e coloque o ventrículo de volta na placa de Petri. Pique o coração usando uma lâmina cirúrgica em pequenos cubos de um milímetro cúbico.
Fixar e imergir o tecido cardíaco dissecado em solução de glutaraldeído e cacodilato durante 24 horas a quatro graus Celsius. Após 24 horas de fixação, lave o tecido em tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar duas vezes por 20 minutos. Remova o tecido do tampão de cacodilato de sódio e mergulhe em solução de tetróxido de ósmio a 2% por quatro horas à temperatura ambiente.
Após a osmicação, imergir o tecido em solução de acetato de sódio a 2% durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe o tecido em solução de acetato de uranila a 2% por uma hora à temperatura ambiente. Após a coloração com acetato de uranila, desidrate o tecido sequencialmente através dos álcoois graduados e da acetona.
Incorpore o tecido desidratado em resina epóxi de baixa viscosidade, conforme descrito no manuscrito. Coloque o tecido em resina fresca em micromoldes de oito milímetros e cure o tecido incorporado a 70 graus Celsius durante a noite. Depois de encontrar a área de interesse, usando uma faca ultra 45 graus, produza seções ultrafinas de ouro pálido.
Coloque essas seções ultrafinas no lado opaco de uma grade de cobre de malha 200. Inicie a coloração desmascarando o antígeno colocando 20 microlitros de metaperiodato de solução de gravação em um filme de parafina limpo. Coloque a grade seca com seções de tecido na gota da solução de gravura.
Deixe a grelha de secção sobre a solução durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lave as seções de tecido gravadas colocando-as em uma gota de água destilada por 60 segundos. Bloquear os aldeídos residuais colocando a grelha de secção numa gota de 0,05 solução molar de glicina durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Coloque as bordas da grade no papel de filtro para remover a solução residual de glicina. Coloque a grelha de secção em 10 a 20 microlitros de solução de bloqueio durante 25 minutos à temperatura ambiente. Limpe as bordas da grade no papel de filtro e coloque as seções da grade no diluente de anticorpos para condicionamento à temperatura ambiente por 10 minutos.
Incubar as seções da grade com anticorpo primário por uma hora e 30 minutos em uma câmara umidificada. Seque a grade e lave as seções da grade com diluente de anticorpos duas vezes por cinco minutos cada. Incubar as seções da grade com anticorpo secundário biotinilado por uma hora em uma câmara umidificada.
Uma vez que a grade esteja seca, lave as seções da grade com diluente de anticorpos duas vezes por cinco minutos cada. Incubar as secções da grelha em QD conjugado com estreptavidina comercialmente disponível durante uma hora numa câmara à temperatura ambiente. Evite a exposição à luz cobrindo a câmara com papel alumínio.
Depois de secar as bordas da grade usando papel de filtro, lave as seções da grade colocando-as em gotículas de água por dois minutos e limpe as bordas da grade para secar. Insira o suporte do espécime na coluna do microscópio e engate o interruptor da bomba para avaliar o goniômetro, seguido da inserção completa do suporte do espécime na coluna do microscópio. Concentre-se bem na área desejada.
Capture a imagem usando uma câmera digital de alta velocidade e salve o arquivo no formato tif. As membranas mitocondriais, lisossomos e a interface mitocondrial do retículo endoplasmático ou da membrana do retículo sarcoplasmático mostraram a presença de pontos quânticos marcados com Sigmar1. Cortes cardíacos foram visualizados usando imunoglobulina G de coelho e pontos quânticos como controle isotipo para o anticorpo primário anti-Sigmar1 coelho.
Uma coisa importante a considerar ao trabalhar neste protocolo é desmascarar o tempo de antígeno. Se as seções de tecido forem gravadas por muito tempo, a solução de metaperiodato criará perfurações em seções de tecido finas. A marcação mediada por pontos quânticos está ganhando atenção na detecção de tumores, no perfil molecular e imunológico do tumor e na imagem de tecidos, abrindo um novo caminho para o diagnóstico médico.
Os pontos quânticos também são úteis no tratamento de tumores através de terapias fotodinâmicas e anomalias oftálmicas, fornecendo medicamentos aos olhos.
