Nosso modelo é altamente relevante para doenças de desmielinização, especialmente a esclerose múltipla. E pode contribuir para o avanço relacionado à pesquisa clinicamente relevante. É um protocolo detalhado que pode causar desmielinização severa rapidamente e facada em camundongos por procedimento cirúrgico.
Ao tentar essa técnica pela primeira vez, seja paciente e garanta que as coordenadas sejam precisas. Comece conectando uma agulha de calibre 32 a uma seringa de 5 microliter. Retire 5 microliters da solução LPC para a preparação da injeção.
Em seguida, confirme a profundidade da anestesia do mouse pela falta de reflexo de beliscar o dedo do dedo do dedo enquanto a respiração é lisa. Posicione o mouse na estrutura estereotaxic com o lado dorsal para cima, e fixe a cabeça com um cone de nariz e grampo de dente. Fixar o mouse no aparelho estereotaxico com barras de ouvido bilaterais.
Certifique-se de que as barras de ouvido estão nivelados e a cabeça está horizontal e estável. Desinfete a pele da cabeça limpando com iodophor. Em seguida, use bisturi para cortar uma pequena incisão para cerca de 1,5 centímetros ao longo da linha média do couro cabeludo para expor o crânio.
Limpe a habilidade com um cotonete mergulhado em peróxido de hidrogênio de 1% até que a bregma, lambda e fontanelle posterior sejam expostas. Coloque a seringa no aparelho estereotaxic. Certifique-se do posicionamento horizontal da cabeça do animal e localize o corpo caloso.
Uma vez que o local de injeção é determinado, registe as coordenadas, e faça uma marca com um marcador no crânio. Perfurar suavemente o local marcado com uma broca de crânio. Tome cuidado para evitar qualquer sangramento.
Mova lentamente a agulha para as coordenadas dadas. Para induzir a desmielinização do corpus callosum, injete 2 microliters de solução LPC em cada local de injeção a uma taxa de 0,4 microliters por minuto. Após a injeção, mantenha a agulha em cada local por mais 10 minutos.
Por fim, suturar a pele com uma sutura 4-0, e esperar o animal acordar em 10 minutos. A imagem representativa mostra a detecção das legiões de matéria branca através da mancha azul rápida de Luxol. A partir dos resultados, a desmielinização estável do corpus calosum pode ser vista aos 10 e 28 dias após a injeção.
A quantificação da área de desmielinização em diferentes pontos de tempo é mostrada aqui. Através da coloração da imunofluorescência de proteína básica degradada da mielina, observou-se um notável aumento de dMBP no grupo injetado pelo LPC aos 10 dias após a injeção, o que representa a perda de mielina no caloso corpus. A análise da mancha ocidental da proteína básica da mielina, ou MBP, expressão mostrou uma perda significativa de MBP após a injeção de LPC.
Beta-actin foi usado como controle de carregamento para medir a expressão da linha de base. Imagens de microscopia eletrônica confirmam a ultraestrutura mieliada no corpo caloso do grupo sham e do grupo injetado pelo LPC. GST-pi é o marcador da célula precursora oligodendrocyte, ou OPC, maturação de diferenciação.
Após 10 dias de injeção de LPC, o GST-pi diminuiu em comparação com o grupo falso. Ao mesmo tempo, a capacidade de proliferação dos oligodendrócitos pode ser refletida pela proporção de oligodendrócitos proliferam e as células de linhagem total de oligodendrocytes. A maior proporção representa mais proliferação de oligodendrócitos após 10 dias após a injeção.
As imagens representativas mostram o caminho de natação dos ratos em cada grupo, na presença da plataforma e após a remoção da plataforma. Os resultados sugerem que a memória espacial de camundongos desmielinados é significativamente prejudicada no modelo de injeção LPC de dois pontos. Ao tentar este procedimento, certifique-se de que a taxa de injeção é precisa, e mantenha a agulha em cada local por mais 10 minutos.
