This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates - Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.

NOTA: Os animais utilizados neste procedimento foram tratados de acordo com a Canadian Council on Animal Care (CCAC) orientações. Ética foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da Universidade de Calgary. 1. Prepare a seringa para a injeção <ol><li> Dissolve-se lisolecitina para uma solução a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) e armazenar a -20 ° C em pequenas aliquotas (75 ul). Descongelar um frasco à temperatura ambiente. NOTA: se lisolecitina é não dissolvido, sonicar o tubo num aparelho de limpeza de ultra-sons (40 kHz) durante aproximadamente 30 minutos para formar uma solução uniforme. </li><li> Lidar com o capilar de vidro pré-puxou com extremo cuidado para não danificar a ponta delicada. Desaperte a porca de uma seringa injetar 10 ul e passe-o para a parte plana do capilar seguido por 2 ponteiras, garantindo que os fins de acasalamento das virolas alinhar e capilar é confortável na ponteira cónica (Figura 1). Lavar a seringa com isopropálcool il e remover o êmbolo. Depois de seco, o parafuso do lado conjunto de agulha apertado na seringa de injeção. </li><li> Coloque a agulha de metal hub para a seringa priming. Pierce um disco de borracha com a agulha e deslize-o para a base. Encha a seringa aspirante com lisolecitina. Suavemente deprimir a seringa priming até que o líquido é visível na ponta da agulha. Isto assegura bolhas de ar não será introduzido na seringa de injecção. </li><li> Insira a agulha de metal hub da seringa priming para a seringa de injecção. Fazendo uma vedação firme com o disco de borracha, aperte lentamente a seringa preparação até que o capilar enche até a ponta com a solução. Remover cuidadosamente a seringa priming enquanto simultaneamente pressionando para encher o cilindro da seringa de injecção de sem introduzir bolhas de ar. Inserir o êmbolo na seringa de injecção e assegurar a solução flui a partir da ponta do capilar medida que o êmbolo é pressionado suavemente. NOTA: Se as bolhas de ar são visíveis na tampaIllary ou injecção de seringa, a preparação da seringa deve ser repetido desde o início. Fluido contínuo no aparelho de injecção é crítico para assegurar o volume de injecção precisos. </li><li> Ligue a seringa injetar completou para o braço de um micromanipulator estereotáxica. Este aparelho completou será capaz de injectar 15-20 animais antes de precisar de ser reabastecido. </li><li> Descartar a lisolecitina restante da seringa priming. Retirar e deprimir álcool isopropílico várias vezes, e retirar a agulha hub metal. Esperar algumas horas para que o álcool isopropílico restante na seringa priming para evaporar antes de encher novamente. </li></ol> 2. Prepare-se de animal para o procedimento cirúrgico NOTA: Este procedimento é descrito para o sexo feminino camundongos C57BL / 6, com idades entre 8-10 semanas. <ol><li> Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal de cetamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) ou por regulamentação de cuidados de animais institucionais. Plano para aanimal a ser sob anestesia para cerca de 1 hora, se utilizar a anestesia injectável. </li><li> Teste de que o animal é anestesiado profundamente com firmeza que comprime o pé. Um animal de devidamente anestesiados não vai responder ao aperto. </li><li> Usando clippers, raspar a 2 cm área 2-3 no lado dorsal do animal, perto das orelhas. Tenha cuidado para não danificar os ouvidos. </li><li> Limpe a área limpa com etanol 70% aplicada a uma compressa de gaze. Assegurar-se que o cabelo cortado foi removida da área. Desinfectar a área com iodo. </li><li> Aplicar vaselina para os olhos para evitar a secagem durante todo o procedimento. </li><li> Manter o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que esteja pronto para iniciar o procedimento. </li></ol> 3. Execute o procedimento cirúrgico NOTA: Certifique-se de uma técnica asséptica adequada para todas as etapas do processo. Isso inclui o uso adequado de luvas, toucas, máscaras e cortinas. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes de vir em contact com o animal. <ol><li> Mova o animal a um quadro estereotáxico, lado dorsal up, elevada no meio, seção por toalhas de papel dobradas para exagerar a curvatura da coluna vertebral. Prenda os braços e cauda com esparadrapo e proteger a cabeça com um grampo de dente. Estabilizar barras de ouvido não são necessárias para este procedimento. </li><li> Usar um bisturi para fazer uma incisão na linha média, 3 cm, começando logo abaixo das orelhas e corte na direcção caudal. </li><li> Localize o fosso entre as duas grandes estruturas adiposas e usar uma pinça fina em cada mão para retirar estes apart. Espalhe afastadores para abrir o campo cirúrgico. </li><li> Sob um microscópio cirúrgico, localize o processo de crescimento proeminente da vértebra T2 (Nota: este recurso é característica da C57BL / 6 do mouse estirpe). Realize uma dissecção romba com tesoura primavera fechados através da musculatura sobreposição para melhor visualizar T2. Usando a pinça, sentir para as superfícies duras de T3 e T4 para confirmar localização anatômica correta. </li><li> Com uma tesoura primavera, fazer cortes laterais rasas (2-3 mm de profundidade) do tecido conjuntivo entre T3 e T4. Devido ao espaçamento natural entre as vértebras torácica na porção superior da coluna vertebral do rato, uma laminectomia não é necessário para revelar a medula espinhal. Esteja consciente de que muito fundo um corte irá perfurar e danificar o cabo. NOTA: Um pequeno grau de sangramento é comum durante este passo. Se isso ocorrer, mantenha uma lança esponja na área até que os subsídios sangramento (30-60 seg). </li><li> Visualizar a medula espinhal. Vai ser coberto com uma espessa camada de dura-máter visível se esta camada meníngea ainda não foi cortado, mas expondo o cabo. Um vaso sanguíneo proeminente corre caudal / rostral através da linha média aproximada da medula espinhal. NOTA: Este vasculatura não deve ser usada como um ponto de referência para a linha média. Em vez disso, iluminação adequada deve revelar os limites da matéria branca e cinzenta que flanqueiam a coluna dorsal, e estes devem ser usados ​​para estimar a linha média. </li><li> Se a dura-máterpermanece intacta, fazer arranhões laterais suaves com uma agulha de metal G 32 até que seja limpa. O objectivo é remover a dura-máter ao mesmo tempo que não corta as meninges subjacentes restantes, que não são tão espessa e difícil de ver. NOTA: Lançamento do líquido cefalorraquidiano indica uma violação da aracnóide e enquanto isso pode ocorrer sem danos mecânicos ao tecido, o fluido cerebrospinal acumulada deve ser removida com uma lança esponja para melhor visualizar a superfície do fio. </li><li> Mover a seringa no lugar e injectando lentamente baixar até a ponta do capilar apenas mal toca na medula espinhal imediatamente lateral de cada lado da linha média. Bloqueie o braço no lugar. </li><li> Use as medições graduais do braço estereotáxica direcção Z para fazer uma medição da posição da linha de base. A partir desta leitura, subtrair 1,3 milímetros. Use um movimento descendente rápida e superficial para furar o tecido e abaixe cuidadosamente o capilar até que a nova medida é atingido. Opcional: se desejado,lesões na coluna dorsal pode ser produzido pelo mesmo movimento de perfuração na linha média e uma profundidade de 0,3 mm (ver a discussão para mais informação). NOTA: Estes valores são específicos para injetar entre T3 e T4. Se optar para executar a injecção em qualquer outro local na medula espinal, estes valores têm de ser derivados a partir de qualquer atlas do cérebro do rato disponíveis. </li><li> Use a micromanipulator para deprimir lisolecitina na substância branca da medula espinhal ventral. Adicione uma rotação do micromanipulador a cada 5 segundos durante 2 minutos, resultando num volume final de 0,5 mL. Deixe o capilar no local por 2 min adicionais para evitar o refluxo da solução, e em seguida, retire cuidadosamente o capilar. </li><li> Amarrar um único fio de sutura no tecido muscular / adiposo que se sobrepõe à coluna vertebral. Utilize uma sutura não interrompida para fechar a pele. Aplique mais iodo para o local da incisão. </li><li> Colocar o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que se recupere, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola. Aplicar analgésicos pós-operatório conforme a legislação de cuidados de animais institucionais. Cuidados pós-operatórios adicionais normalmente não é necessário, pois os animais são totalmente ambulatorial e capaz de auto-alimentação e beber logo que a recuperação da anestesia. </li><li> Repita o procedimento para os restantes animais. NOTA: Com a proficiência, a operação pode ser concluída em 10-15 min por animal, em particular com a ajuda de uma segunda pessoa amarrando suturas. O mesmo capilar de vidro pode ser utilizado para cerca de 15-20 antes de cirurgias a ponta ficar romba e deve ser substituído. Cirurgias de controlo pode ser realizado de forma idêntica à descrita, com uma injecção de PBS na espinal-medula, em vez de lisolecitina. Nós não recomendamos a limpeza dos capilares para uso futuro. </li></ol> 4. Tissue Processamento e Análise <ol><li> Sacrificar os animais com uma overdose intraperitoneal de cetamina (500 mg / kg) e xilazina (25 mg / kg) em pontos de tempo desejados. As lesões normalmente evoluir no exerdevido maneira: 1-3 dias, desmielinização ativa; 3-7 dias, recrutamento OPC; 7-10 dias, a diferenciação oligodendrocyte; 10-21 dias, remielinização ativa 2,10,11. </li><li> Para preparar o tecido para exame histológico, realizar primeiro uma perfusão transcardial com 12 20 ml de PBS temperatura ambiente seguido por 20 ml de gelo-frio paraformaldeído a 4% em PBS. Para a preparação de resina de tecido embebido para seccionamento semi- ou ultrafina, veja o passo 4.9. </li><li> Remover a medula óssea utilizando uma tesoura para cortar através de curvas cada vértebras começando na extremidade cervical da coluna vertebral e trabalhando para baixo para o nível torácico inferior. Fixar as medulas espinais O / N em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° C. Mudar os cabos a 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante pelo menos 72 horas. </li><li> Identificar o local da injecção como uma anormalidade na superfície dorsal da medula espinhal. Cortar uma pe 3 mm de tecido (com o local da injecção no centro) e alinhar as peças em cryomolds contendo temperatura de corte óptima (OCT) compound. Suspender o lado de baixo dos cryomolds numa mistura gelada de 2-metilbutano e gelo seco até o OCT é completamente congelada. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para seção. </li><li> Secção medulas espinhais de um criostato com uma largura de 20 um em lâminas de microscópio e deixar secar ao ar S / N antes de armazenar as lâminas a -20 ° C. </li><li> Detectar a localização da lesão e tamanho usando um eriocromo cyanine mancha histológica de mielina 13. Execute todas as etapas na RT. Lâminas de ar seco durante 30 minutos. Colocar as lâminas em agente para 1 min, seguido de re-hidratação em soluções de etanol graduadas (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, água) para limpar 1 min cada. <ol><li> Colocar as lâminas em solução de cianina eriocromo durante 15 min, seguido por uma lavagem de 1 minuto com água. Diferenciar em hidróxido de amónio a 0,5% durante 10 segundos, seguido de uma lavagem de 1 minuto com água. Desidratar em soluções de etanol classificados (ordem inversa, como descrito acima) durante 1 min cada, lamela com meios de montagem, e imagem em um brilhante em campo microscope. </li></ol></li><li> Use imunohistoquímica para visualizar os axônios e mielina. Lâminas de ar seco durante 30 minutos. Desidratar com etanol graduado (água, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%), durante 2 minutos cada à temperatura ambiente, em seguida a ordem inversa de volta à água. Este passo resulta numa maior resolução de anéis individuais de mielina 14. <ol><li> Bloquear interacções não específicas de anticorpos, utilizando 10% de soro de cabra e 0,25% de triton X-100 em PBS durante 60 min à temperatura ambiente. Dilui-se anticorpos primários (anticorpo de ratinho anti-SMI312 1: 2.000, de coelho anti-MBP 1: 1000) em PBS e incubar em lâminas de O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar 5 vezes durante 5 min com PBS à temperatura ambiente. Dilui-se os anticorpos secundários (Alexa 488 anti-coelho a 1: 500, Alexa 546 anti-rato a 1: 500) em PBS e incubar em lâminas durante 60 minutos à RT. Lavar 5 vezes durante 5 min com PBS à temperatura ambiente. Monte desliza com lamelas usando gelvatol e imagem num microscópio fluorescente. </li></ol></li><li> Use imunohistoquímica para visualizar as células da linhagem de oligodendrócitos. Siga o procedimento para step 4,7, omitindo o passo de desidratação / re-hidratação, e usando 10% de soro de cavalo, em vez de soro de cabra. Use as seguintes diluições de anticorpos primários: anticorpo de cabra anti-PDGFRα 1: 100, de ratinho anti-CC1 1: 200, de coelho anti-Olig2 1: 200. Use as seguintes diluições secundárias: Alexa 488 anti-cabra 1: 500, Alexa 594 anti-rato de 1: 500, Alexa 647 anti-coelho 1: 500. </li><li> Para preparar o tecido para o corte semi- ou ultrafina, em primeiro lugar executar uma perfusão transcardial 12 com 20 ml RT PBS seguido de 20 ml gelada paraformaldeído 4% / 1% em PBS. Remover medula espinal, tal como descrito na etapa 4.3. Fix O / N em paraformaldeído a 4% / glutaraldeído a 1% em PBS a 4 ° C. </li><li> Identificar o local da injecção tal como descrito no passo 4.4. Cortar um pedaço de 1 mm com tecido contendo o local de injecção. Blocos Adicionais 1 mm de cada lado da lesão pode ser preparado, bem como se desejar. </li><li> Numa hotte, adicionar 10 vezes o volume de 1% de tetróxido de ósmio / 1,5% de ferrocianeto de potássio para cada bloco em gelodurante 60 min. NOTA: tetróxido de ósmio é uma substância altamente tóxica e deve ser tratado com extremo cuidado. Todos os materiais em contacto com tetróxido de ósmio deve ser colocada em óleo de milho (duas vezes o volume de solução de tetróxido de ósmio) para neutralização. </li><li> Lavar os cabos 3 vezes com 0,2 M de cacodilato durante 10 min à TA, descartando em óleo de milho. Desidratar com soluções de etanol graduadas (água, 50%, 70%, 90%, 2 vezes com 95%, 2 vezes, com 100%, 2 vezes com óxido de propileno) durante 10 minutos à RT. </li><li> Cabos de inserir em resina, conforme as instruções do fabricante. </li><li> Cortar blocos em um ultramicrotome e montar secções em gotículas de água em lâminas de microscópio. Colocar as lâminas em uma placa quente (aproximadamente 50 ° C) até secarem. </li><li> Visualize mielina, adicionando algumas gotas de 1% toluidina solução bórax / 2% para os slides para 10-15 seg a 50 ° C. Enxágüe com água, seca e lamela com media de montagem. Seções imagem em um microscópio de campo claro. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Um número de modelos animais têm sido desenvolvidos para estudar MS, reconhecidamente mais o modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE). Em EAE, roedores são imunizados contra um fragmento de um péptido de mielina e submetidos a um desenvolvimento lesão inflamatória manifestando em paralisia ascendente. Embora este modelo tem sido útil para testes pré-clínicos de medicamentos imunomoduladores MS, não é ideal para estudar a remielinização por três razões principais: em primeiro lugar, a localização de lesões inflamatórias é um pouco aleatório, e localização de lesões durante o processamento de tecidos para semi- ou ultrafino seções pode ser um desafio. A segunda é que a remielinização ocorre ao longo de um período de tempo específico, e a idade exata de uma única lesão EAE não pode ser conhecido sem contínua não-invasivo ressonância magnética. O terceiro é que a remielinização é um fenómeno que ocorre naturalmente em roedores, e evidências de remielinização após o tratamento de droga na EAE pode não ser o resultado primário da droga, mas emStead um fenômeno secundário de reduzir a inflamação. Outro método comum de produção de desmielinização é conseguido através da introdução do agente quelante de cobre cuprizona na dieta. Isso resulta em desmielinização generalizada, principalmente no corpo caloso. Há limitações no estudo do corpo caloso como um site de remielinização, pelas seguintes razões: em primeiro lugar, os diâmetros dos axônios (e, assim, a espessura da mielina) são menores do que outras regiões do SNC, e bainhas assim fina remielinizados podem ser indistinguíveis daqueles que nunca foram demyelinated. Em segundo lugar, porque o corpus callosum rato contém&gt; 70% de axónios sem mielina 16, pode não ser claro se um segmento remielinizados é verdadeiro reparação de mielina danificada ou a síntese de novo da mielina no adulto, o qual ocorre normalmente 17. É da nossa crença de que o melhor modelo para estudar a remielinização é a injeção direta de toxinas, ou lisolecitina, ethidbrometo de ium, ou outros, para os pedúnculos cerebrais caudais 18 ou a substância branca da medula espinhal. O ex-localização só é conseguida através de injeção estereotáxica de 3 dimensão precisa, e está limitada a maiores roedores (ratos), devido ao pequeno tamanho dos pedúnculos cerebelares. Isso exclui o recurso extensivo de camundongos transgênicos em estudar de- e remielinização. A medula espinhal, no entanto, contém muitos grandes tratos de substância branca, que são facilmente acessíveis cirurgicamente. Os espaços entre as vértebras no segmento torácico rostral permite a exposição da medula espinal, sem a necessidade de uma laminectomia, que é um passo necessário para procedimentos cirúrgicos torácicos caudais. Uma vantagem de visar especificamente a substância branca ventral é que os axónios são uniformemente maior do que a substância branca dorsal, fazendo quantificação de remielinização uma função análoga para os desafios associados com o corpo caloso menos ambíguo. Além disso, a substância branca ventral torna-se uma muito maior target zona para injectar; várias centenas de microns lateralmente na região dorsal colocaria o capilar fora da coluna, enquanto o mesmo desvio ventralmente ainda produziria uma lesão desmielinizante proeminente. Alguns protocolos de injectar lisolecitina em ambos dorsal e ventral de colunas do mesmo animal 19. Isto pode aumentar tanto a probabilidade de colocação capilar adequado e o número de lesões quantificáveis ​​em menos animais. Embora os dados atuais apresentados é 8-10 semanas animais velhos no momento da operação, também tiveram sucesso usando o mesmo procedimento em camundongos velhos 8-10 meses, onde remielinização é descrito como sendo marcadamente mais lento 4. Quantificação de remielinização não é uma tarefa trivial. Um dogma central postula que segmentos remielinizados são mais curtos e mais fino, em média, do que suas contrapartes saudáveis ​​e, assim, cálculos g-Ratio (diâmetro do axônio dividido pelo axônio + diâmetro mielina) de transversal semi-oseções r ultrafinos tornaram-se procedimento padrão. No entanto, sabe-se que os segmentos remielinizados engrossar com o tempo de 2 e um estudo recente usando um repórter transgénico de oligodendrócitos remielinizante sugere que muitos entrenós eventualmente tornar-se indistinguíveis de controle 20. Quantificar o número de oligodendrócitos maduros dentro da lesão é uma forma indireta de medir reparação, como oligodendrócitos são capazes de fazer um grande número de entrenós, e uma proporção significativa de no modelo dependendo-remielinização usada-pode ocorrer a partir de células de Schwann 3. É claro que, como a remielinização tem sido associada a restauração de condução saltatory 21, a métrica de reparação final seria a recuperação funcional de défices neurológicos. Enquanto a remielinização tem sido relacionada com a recuperação da função em algumas espécies 22,23, não tornou-se um procedimento padrão em estudos murinos lisolecitina. Isto é provavelmente devido a uma falta de observ ostensivasdéficits capazes de lesões ou dorsal ou ventral, em comparação com modelos desmielinização mais robustas, como EAE e até mesmo cuprizona. Acreditamos que os déficits funcionais resultantes de lisolecitina injeção, e posterior recuperação com remielinização, só será observável por meio de testes sensíveis de funcionamento sensório-motor fino. A pesquisa PubMed de &quot;remielinização&quot; ao lado de qualquer um dos modelos animais listados acima, ainda que uma abordagem metodológica brusque, mostra menos acertos de pesquisa para lisolecitina (109) em comparação com EAE (188) e cuprizona (197). Se o nosso argumento de que lisolecitina desmielinização é a abordagem superior para estudar a remielinização, por que é o menos discutido? Talvez uma apreensão para usar este método deriva da crença de dificuldade técnica na realização da intervenção cirúrgica. Na realidade, este procedimento é rápido, custo-benefício, e não é mais difícil do que a dissecação de tecidos de rotina, exigindo materiais que são todos commercialmente disponível. É nossa esperança que este protocolo se mostrou útil para aqueles que desejam adicionar este modelo poderoso para o seu repertório para estudar o campo emocionante e expansão de reparação da mielina.

A esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante crónica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada pela infiltração de células imunológicas e placas contendo perdidos de mielina, oligodendrócitos, neurónios e axónios. A maioria dos pacientes tem um curso de doença consiste em recaídas inflamatórias acompanhados por uma vasta gama de sintomas neurológicos, seguidos de períodos de remissão. Mais da metade desses pacientes, eventualmente, fazer a transição para uma fase secundária progressiva sem seqüelas aparentes, mas contínuo declínio neurológico. Acredita-se que esta deterioração progressiva é devido a lesão axonal e perda, contribuiu, em parte, pela desmielinização crónica. Estratégias para restaurar a mielina perdido, sendo reconhecida como uma abordagem de tratamento promissora para retardar a progressão da doença e talvez reverter os sintomas neurológicos. Remielinização é uma resposta de reparação endógena no sistema nervoso central através do qual novos bainhas de mielina são geradas a partir de células precursoras de oligodendrócitos recrutados(OPC) que se diferenciam em oligodendrócitos formadoras de mielina. Remielinização tem sido demonstrado em modelos animais para ser bastante robusta 1-3, no entanto, a sua eficiência diminui com a idade de 4 anos. Com efeito, a remielinização ocorre em seres humanos embora seja incompleta na maioria dos pacientes com EM 5. Todos os medicamentos actualmente disponíveis para o MS como alvo principalmente o componente imune aberrante da doença e, enquanto eficaz na redução de recaídas, não significativamente retardar a progressão da doença. A próxima geração de estratégias terapêuticas para o tratamento da EM vai integrar avanços na imunomodulação, com o reforço da remielinização endógeno, a fim de evitar que os dois recaídas e progressão 6. Um método para estudar mento e remielinização no SNC envolve a injecção directa do lisofosfatidilcolino detergente (lisolecitina) para a medula espinhal 1,3,7 substância branca. Este procedimento produz um demyelinat bem caracterizadoing prejuízo, que consiste principalmente de macrófagos / infiltração microglial e ativação 8,9, astrogliosis reativa, perturbação da homeostase axonal / lesão axonal, e da proliferação e migração OPC 10. A lesão evolui de maneira previsível durante o período de algumas semanas e, eventualmente, é capaz de totalmente remielinizante. Este método tem sido particularmente útil no estudo da coreografia dos eventos envolvidos na despolarização e remielinização. Além disso, ele foi adotado como uma ferramenta para testes pré-clínicos de terapias candidatos a acelerar a reparação após um insulto desmielinizante.

<table><tbody><tr><td>spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17003-03</td><td></td></tr><tr><td>clippers</td><td>Philips</td><td>QG3330</td><td></td></tr><tr><td>heating recovery chamber</td><td>Peco Services</td><td>V1200</td><td></td></tr><tr><td>surgical tape</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>scalpel blade</td><td>Feather</td><td>No. 15</td><td></td></tr><tr><td>sponge spear</td><td>Beaver Visitec</td><td>581089</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl sutures</td><td>Ethicon</td><td>J511G</td><td></td></tr><tr><td>curved ToughCut spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15123-12</td><td></td></tr><tr><td>32 G metal needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>needle holders</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>angled forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>cotton tipped applicator</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>gauze pads</td><td>Safe Cross First Aid</td><td>3763</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l syringe</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>make sure to purchase the microliter, not gastight syringe</td></tr><tr><td>compression fitting</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td>contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 &amp;mu;l syringe is a tighter fit</td></tr><tr><td>priming kit</td><td>Hamilton</td><td>PRMKIT</td><td>contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs</td></tr><tr><td>pre-pulled glass capillaries</td><td>WPI</td><td>TIP10TW1 (pack of 10)</td><td>contains capillaries with 10 &amp;mu;m inner diameter. 30 &amp;mu;m inner diameter also work (TIP30TW1)</td></tr><tr><td>stereotactic frame</td><td>David Kopf instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-20</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek intermediate cryomold</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>bright field microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica EM UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Lysophosphatidylchoine</td><td>Sigma</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-SMI312 antibody</td><td>Covance</td><td>SMI-312R</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Goat anti-PDGFR&amp;alpha; antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1062</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Olig2 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Mouse anti-CC1 antibody</td><td>Calbiochem</td><td>OP80</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG</td><td>Life technologies</td><td>A-11003</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>705-546-147</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-586-151</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-606-152</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>CDMV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xylazine</td><td>CDMV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iodine</td><td>West Penetone</td><td>2021</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline petroleum jelly</td><td>VWR</td><td>CA05971</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome Cyanine R</td><td>Sigma</td><td>32752</td><td></td></tr><tr><td>sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>iron(III) chloride</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>ammonium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>320145</td><td></td></tr><tr><td>Acrytol</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801700</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>horse serum</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Electron Micrscopy Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>osmum tetroxide</td><td>Electron Micrscopy Sciences</td><td>19150</td><td>highly toxic</td></tr><tr><td>potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>corn oil</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>polyvinyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>cacodylic acid</td><td>Electron Micrscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>propylene oxide</td><td>Electron Micrscopy Sciences</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>EMBED kit</td><td>Electron Micrscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate decahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9640</td><td></td></tr><tr><td>Recipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome cyanine solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingredient</td><td></td><td></td><td>Amount to add</td></tr><tr><td>Eriochrome Cyanine R</td><td></td><td></td><td>0.8 g</td></tr><tr><td>sulfuric acid</td><td></td><td></td><td>400 ml 0.5%</td></tr><tr><td>iron(III)chloride</td><td></td><td></td><td>20 ml 10%</td></tr><tr><td>water</td><td></td><td></td><td>80 ml</td></tr><tr><td>*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelvatol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingredient</td><td></td><td></td><td>Amount to add</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>140 mL</td></tr><tr><td>polyvinyl alcohol</td><td></td><td></td><td>20 g</td></tr><tr><td>glycerol</td><td></td><td></td><td>40 g</td></tr><tr><td>*mix well, place at&amp;nbsp; 37 &amp;deg;C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin

A esclerose múltipla é uma doença desmielinizante inflamatória do sistema nervoso central, caracterizada por formação de placas contendo oligodendrócitos perdidos, mielina, axónios e neurónios. Remielinização é um mecanismo de reparação endógena nova mielina pelo qual é produzida a proliferação subsequente, recrutamento e diferenciação de células precursoras de oligodendrócitos em oligodendrócitos formadoras de mielina, e é necessária para proteger os axônios de danos adicionais. Actualmente, todos os agentes terapêuticos para o tratamento de esclerose múltipla a identificar o componente imune aberrante da doença, o que reduz as recaídas inflamatórias, mas não evitam a progressão irreversível declínio neurológico. Portanto, é imperativo que as estratégias de promoção da remielinização ser desenvolvido que pode atrasar a progressão da doença e talvez reverter os sintomas neurológicos. Existem diversos modelos animais de desmielinização, incluindo a encefalomielite auto-imune experimental e curprizone; no entanto, há limitações em seu uso para estudar a remielinização. Uma abordagem mais robusta é a injecção focal de toxinas para o sistema nervoso central, incluindo a lisolecitina detergente na matéria branca da medula espinhal de roedores. Neste protocolo, demonstramos que o procedimento cirúrgico envolvido em injetar lisolecitina na matéria branca ventral de ratos é rápido, custo-benefício, e não requer materiais adicionais do que as disponíveis no mercado. Este procedimento é importante não só para estudar os eventos normais envolvidas no processo de remielinização, mas também como uma ferramenta de pré-clínico para o rastreio de candidatos terapêuticos promotoras remielinização.

Injecção focal de lisolecitina na matéria branca ventral produz uma lesão desmielinizante discreta que é detectável por uma distância de aproximadamente 3 mm (Figura 2). Coloração imuno-histoquímica do núcleo lesão de mielina (MBP) e axônios (SMI312) mostra axônios que foram despojados de mielina em 7 dias (Figura 3). Por 14 dias, muitos axônios são cercados por anéis de MBP-positivos, o que sugere a ocorrência de remielinização. A coloração para células da linhagem de oligodendrócitos (PDGFRα, Olig2, CC1), há um aumento significativo tanto no número total de células em 14 dias em comparação com 7 dias, assim como a distribuição de oligodendrócitos maduros em comparação com OPCs (Figura 4) . Consistente com essa descoberta, secções cortes semifinos corados com azul de toluidina revela a presença de bainhas de mielina fina aos 14 dias que raramente são detectados em 7 dias (Figura 5), indicando que estes são remielinizados internodes. O procedimento é altamente reprodutível entre animais. A variação ocorre quando a respiração pesada altera a posição estacionária do capilar-isso geralmente não é um problema com sedação adequada. Danos aos axônios parece ser mínimo, exceto no centro da lesão, o que tem sido descrita desde o primeiro uso do modelo 1. Acreditamos que este seja o trauma mecânico do capilar de vidro, como também é observável em PBS injetado controles. No entanto, a variabilidade tende a ser pequeno, e nós e os outros usando um procedimento semelhante detectaram diferenças entre as condições experimentais com apenas 4 animais por grupo 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> Figura 1. Montagem da seringa de injecção. (A) A porca da seringa de injecção é enroscada t<html> ele extremidade plana do capilar de vidro, seguido por 2 a virolas de tal modo que o seu acasalamento termina encravamento. Uma vez que o capilar está firmemente confortável no ponteira cónica, o conjunto é parafusada mão apertada sobre a extremidade da seringa de injeção. (B) a peça central de um disco de borracha com a agulha hub de metal presa à seringa priming e deslize-o para baixo para a base. (C) Retirar lisolecitina solução para a seringa priming. (D) suavemente deprimir a seringa de preparação até que a primeira gota de lisolecitina é visível na ponta da agulha. (E) Inserir a seringa para dentro do tambor de escorvamento da injecção Seringa, fazendo um selo firme com o disco de borracha. Deprimir a solução suavemente até que ele fique com a extremidade do capilar. Retire cuidadosamente a seringa priming, mantendo a pressão sobre o êmbolo para remover a agulha de metal hub sem a introdução de bolhas de ar dentro da seringa de injeção.fazer upload / 52679 / &quot;target =&quot; _ 52679fig1large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> Figura 2. representativas lisolecitina lesão coradas com eriocromo cianina. As secções em série (400 mm espaçados aparte) de uma lesão característica lisolecitina aos 14 dias coradas com eriocromo cianina para visualizar mielina (azul). Note-se que a desmielinização está restrita à substância branca ventral e que a lesão se estende por cerca de 3 mm no rostral / direcção caudal. Barra de escala = 1 mm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> Figura 3. Os axônios e mielina emo modelo de lisolecitina. (A) A farsa (PBS) injetado medula espinhal aos 7 dias mostra axônios saudáveis ​​que são cercados por anéis de mielina. (B) A lisolecitina lesão em 7 dias apresentam axônios desnudada, bem como mielina degradada. (C) Aos 14 dias, a proporção de axónios (exemplos assinalados com setas brancas) são associados com o reaparecimento de anéis de mielina. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> Figura 4. Células Oligodendrocyte linhagem no modelo lisolecitina. (A, C) Aos 7 dias, há uma maior representação de PDGFRα + OPCs (barras brancas), em relação a + oligodendrócitos CC1 (barras magenta); os números dentro das barras representam porcentagens. Olig2 foi sondado paraconfirmar a coloração de células da linhagem de oligodendrócitos. (B, C) ​​Aos 14 dias, existe um aumento significativo no número total de células da linhagem de oligodendrócitos, em comparação com 7 dias (p &lt;0,05, bicaudal, t-teste, n = 4 por grupo ). Há também um aumento significativo na distribuição de oligodendrócitos de OPCs em 14 dias, comparado com 7 dias (p &lt;0,0001, teste exacto de Fisher). Escala da barra = 10 m. Cada campo é capturada em um aumento original de 60X. Os valores são média ± DP. * Significa p &lt;0,05. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> Figura 5. remielinização no modelo de lisolecitina. (A) A azul de toluidina transversal manchado cortes semifinos seção da substância branca ventral em um heaimunda rato mostra axónios longo de uma larga gama de calibre com a respectiva espessura de mielina. (B) No dia 7, uma falta de bainhas de mielina é observada adjacente a uma área afectada (inferior direito). (C) Aos 14 dias, as bainhas finamente mielinizadas ( exemplos assinalados com setas vermelhas) aparecem em toda a lesão, indicativo de segmentos remielinizados. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

experimental-demyelination-remyelination-murine-spinal-cord-focal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.9K visualizações.  Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary. Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

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Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Imunologia e Infecção

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Neurociência

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and autism. As evidence suggests that remyelination can effectively ameliorate the disease symptoms, there is an increasing focus on drug development to promote the myelin regeneration process. Thus, a region-selectable and result-reliable drug delivery technique is required to test the efficiency and specificity of these drugs in vivo. This protocol introduces the osmotic pump implant as a new drug delivery approach in the lysolecithin-induced demyelination mouse model. The osmotic pump is a small implantable device that can bypass the blood-brain barrier (BBB) and deliver drugs steadily and directly to specific areas of the mouse brain. It can also effectively improve the bioavailability of drugs such as peptides and proteins with a short half-life. Therefore, this method is of great value to the field of central nervous system myelin regeneration research.

Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System

Demyelination takes place in multiple central nervous system diseases. A reliable in vivo drug delivery technique is necessary for remyelinating drug testing. This protocol describes an osmotic pump-based method that allows long-term drug delivery directly into the brain parenchyma and improves the drug bioavailability, with broad application in remyelination research.

Entrega de drogas baseada em bomba osmótica para pesquisa de remyelination in vivo sobre o sistema nervoso central

Demyelination has been identified in not only multiple sclerosis (MS), but also other central nervous system diseases such as Alzheimer's disease and ...

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). Lysophosphatidylcholine (LPC) is an endogenous lysophospholipid associated with inflammation, and it could induce rapid damage with toxicity to myelin lipids, leading to focal demyelination. Here, a detailed protocol is presented for stereotactic two-point LPC injection that could directly cause severe demyelination and replicate the experimental demyelination injury quickly and stably in mice by surgical procedure. Thus, this model is highly relevant to demyelination diseases, especially MS, and it can contribute to the related advancing clinically-relevant research. Also, immunofluorescence and Luxol fast blue staining methods were used to depict the time course of demyelination in the corpus callosum of mice injected with LPC. In addition, the behavioral method was used to evaluate the cognitive function of mice after modeling. Overall, the two-point injection of lysophosphatidylcholine via a stereotaxic frame is a stable and reproducible method to generate a demyelination model in mice for further study.

The present protocol describes a two-point injection of lysophosphatidylcholine via a stereotaxic frame to generate a stable and reproducible demyelination model in mice.

Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and axonal damage. Currently, there are no measures to cure MS completely, but multiple disease-modifying therapies (DMT) are available to control and mitigate disease progression. There are significant similarities between the CNS pathological features of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and MS patients. EAE has been widely used as a representative model to determine MS drugs' efficacy and explore the development of new therapies for MS disease. Active induction of EAE in mice has a stable and reproducible effect and is particularly suitable for studying the effects of drugs or genes on autoimmune neuroinflammation. The method of immunizing C57BL/6J mice with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) and the daily assessment of disease symptoms using a clinical scoring system is mainly shared. Given the complex etiology of MS with diverse clinical manifestations, the existing clinical scoring system can't satisfy the assessment of disease treatment. To avoid the shortcomings of a single intervention, new indicators to assess EAE based on clinical manifestations of anxiety-like moods and osteoporosis in MS patients are created to provide a more comprehensive assessment of MS treatment.

The present protocol describes the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model using myelin oligodendrocyte glycoprotein and monitoring the disease process using a clinical scoring system. Experimental autoimmune encephalomyelitis-related symptoms are analyzed using mouse femur micro-computed tomography analysis and open field test to assess the disease process comprehensively.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

Biologia

Inducing Local Demyelination in the Optic Nerve Using Lysolecithin

Source: You, Y. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52934">Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure of surgically accessing the optic nerve in an anesthetized animal and precisely delivering lysolecithin to induce focal demyelination, creating neuropathological conditions for further study.

Induzindo desmielinização local no nervo óptico usando lisolecitina

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Ultrastructural Analysis of Demyelination in Mouse Spinal Cord Cross-Sections

Obtain chemically-fixed spinal cord tissue from mice induced with autoimmune demyelination at defined time points during disease progression.
The disease triggers autoreactive immune cells to attack myelin proteins, degrading the myelin sheath surrounding neuronal axons.
Oligodendrocyte precursor cells are recruited to the affected site, mature into oligodendrocytes, and reform the myelin sheath.
Rinse the tissue with a buffer to remove excess fixative, then treat it with osmium, which binds to myelin lipids and enhances contrast for imaging.
Apply heavy metal stains that bind to macromolecules and enhance contrast.
Dehydrate the tissue using increasing alcohol concentrations. Take the tissue embedded in resin and obtain ultrathin sections.
Using electron microscopy, measure the myelin sheath thickness to classify axons as demyelinating with a swollen, thicker sheath, demyelinated with no sheath, or remyelinating with a thin sheath.
Identify axonal damage characterized by reduced spacing between neurofilaments and swollen mitochondria or complete degeneration.
Analyze the progression of axonal damage and repair over time to assess disease progression.

Análise ultraestrutural da desmielinização em cortes transversais da medula espinhal de camundongos

Neuromuscular Disorders

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

Source: Pang, X., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64059">A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Source: Pang, X., et al. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. ...