Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

O método de isolamento de DNA proposto pode servir para estudar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos de camundongos com doenças autoimunes. Um método mais versátil, econômico e eficiente é proposto para obter DNA de amostras fecais que são comparáveis aos kits comercialmente disponíveis. Para começar, tire cada rato individualmente de sua gaiola, colete uma pelota fecal diretamente do ânus e armazene-a a menos 80 graus Celsius até ser processada.

Processe as amostras com pinças, tubos e luvas estéreis e limpos. Adicione um pellet congelado a um tubo de tampa de rosca pré-pesado de dois mililitros e registre o peso fecal em gramas, que deve estar entre 0,02 a 0,05 gramas por pellet fecal. Adicione ao pellet uma fina camada de contas de vidro de 0,1 milímetro, 500 microlitros de tampão de lise e 200 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 20%.

Bead bateu o tubo por quatro minutos em um homogeneizador, seguido por três a cinco minutos de vórtice. Centrifugar os tubos por um curto período de tempo para eliminar as bolhas e espuma. Para extrair DNA das amostras de microbiota, transfira 350 microlitros de sobrenadante de amostra para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mililitros, sem detritos.

Adicione 500 microlitros de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, na proporção de 25:24:1, e o vórtice durante um minuto. Após a centrifugação, transfira 180 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mililitro. Adicione 180 microlitros de clorofórmio, inverta e misture.

A partir disso, transfira 180 microlitros da fase aquosa para um novo tubo de encaixe. Em um armário de biossegurança, adicione 180 microlitros de isopropanol frio e 36 microlitros de acetato de amônio cinco molares. Inverta-o algumas vezes para misturar e coloque o tubo no gelo por 20 minutos.

Descarte o sobrenadante, seguido de lavar os pellets várias vezes com 500 microlitros de etanol a 70% frio. Descarte o sobrenadante e seque o tubo de cabeça para baixo em papel de seda por 20 minutos, até que o pellet fique claro. Suspenda o pellet em 50 microlitros de água de grau molecular e aqueça o líquido a 37 graus Celsius por 10 minutos para dissolver completamente grandes pellets de DNA.

Após o aquecimento, centrifugar esses tubos a 3, 400 vezes G por um minuto para recuperar as gotículas de condensação da tampa. Meça a concentração e obtenha a relação 260/280 usando um espectrofotômetro. Uma proporção para DNA de boa qualidade é geralmente entre 1,8 e dois.

Centrifugar as amostras preparadas a 600 vezes G durante um minuto à temperatura ambiente, antes de congelar a menos 80 graus Celsius durante 24 horas. Em seguida, envie 20 microlitros de amostras com concentrações que variam de um a 50 nanogramas por microlitro para o Argonne National Laboratory para sequenciamento. A estirpe de ratinho sem o recetor CX3CR1 tem uma composição de microbiota intestinal diferente em comparação com ratinhos do tipo selvagem MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, apresenta diferenças significativas em certos géneros, relevantes para bactérias potencialmente patogénicas, como as do filo Proteobacteria.

Tenha cuidado com a contaminação da amostra. Precisa ser estéril. Além disso, é importante pipetar com precisão ao transferir o sobrenadante em um novo tubo.

Este método é adequado para análises moleculares, como PCR, digestão de enzimas de restrição ou construção de bibliotecas genômicas. No lúpus, provamos uma forte relação entre a microbiota intestinal e a progressão do lúpus.