Nosso protocolo descreve como técnicas como cromatografia analítica de exclusão de tamanho de ensaios pull-down, ultracentrifugação analítica e ensaio de chaperoning de histonas podem ser usadas para confirmar se uma proteína é uma chaperona de histonas. As técnicas aqui abordadas, ao utilizar o tandem, poderiam ser aplicadas diretamente para caracterizar um suposto acompanhante. ele poderia ir junto com a técnica de biologia estrutural.
As técnicas são aplicáveis ao campo da pesquisa da cromatina. No entanto, os métodos individuais podem ser aplicados a qualquer outra proteína de interesse, conforme necessário. Demonstrando o procedimento estará o Sr. Surajit Gandhi, um estudante de doutorado do meu laboratório, para o complicado ensaio pull-down;
Archana Samal, um estudante de doutorado, juntamente com o Sr. Ruchir C.Bobde para o experimento analítico de ultracentrifugação;Sr. Somanath Baral, um estudante de doutorado;juntamente com o Sr. Ketul Saharan para o ensaio de super-enrolamento de plasmídeos Primeiro, misture cinco histonas micromolares com dímeros H2A/H2B de 20 micromolares em 300 microlitros de tampão de equilíbrio. Centrifugar o complexo H2A/H2B da chaperona de histonas para remover qualquer precipitado.
Carregue a amostra na coluna de rotação pré-equilibrada com buffer de equilíbrio. Lavar a coluna com 100 volumes de coluna ou quatro mililitros de tampão de lavagem para remover o excesso de dímero H2A/H2B. Em seguida, misture o complexo de histona chaperona H2A/H2B com tetrâmero H3/H4 de 20 a 60 micromolares.
Lavar novamente a coluna com 100 volumes de coluna ou quatro mililitros de tampão de lavagem para remover qualquer tetrâmero H3/H4 não ligado e, em seguida, eluir as amostras com tampão de eluição. Sujeite as amostras eluídas a 18%SDS-PAGE. Em seguida, manche com Coomassie azul brilhante R250 e visualize o gel.
Purificar o dímero H2A/H2B, tetrâmero H3/H4 na chaperona de histonas individualmente com o tampão de diálise utilizando cromatografia analítica de exclusão de tamanho. Salve o buffer da corrida para preparar diluições adicionais mais tarde e para usar como referência na célula AUC. Para amostras AUC, misture as chaperonas purificadas com dímero ou tetrâmero em tubos separados até um volume final de 450 microlitros usando o tampão de diálise salvo para atingir um OD280 de 0,3 a 0,6.
Monte a célula com uma peça central de setor duplo e janelas de quartzo fornecidas com uma ultracentrífuga analítica com um detector de absorbância. Encher 400 microlitros da solução da amostra e 420 microlitros de tampão de diálise nos setores de referência e de amostra da célula, respectivamente. Pese e equilibre com precisão as células e carregue-as em um rotor de titânio de quatro furos.
Alinhe as células usando as marcas na parte inferior das células e do rotor. Carregue o rotor na centrífuga, feche a tampa e inicie a corrida, o que permite que um vácuo se desenvolva e a temperatura se estabilize. Para a análise dos dados, calcule a densidade e viscosidade dos componentes tampão das proteínas e do volume específico parcial com base na composição de aminoácidos da proteína usando o programa SEDNTERP.
Carregue os dados da máquina AUC no programa SEDFIT. Defina o menisco, a linha vermelha, a parte inferior da célula, a linha azul e as linhas verdes dos limites da análise de dados. Escolha Distribuição CS contínua como modelo.
Na seção de parâmetros, defina a resolução máxima até 100. Em seguida, defina o coeficiente de sedimentação mínimo para zero e máximo para 10 a 15. Defina a razão de atrito para 1,2 inicialmente e opte por flutuar para derivar a razão dos dados.
Defina a relação F para 0,68 para regularização de um sigma. Defina o volume específico parcial, a densidade do tampão e a viscosidade obtidos do SEDNTURP. Pressione Executar para permitir que o software resolva a equação lam.
Pressione Ajustar para refinar. Escolha Mostrar pico Mw em CS na função de exibição da barra de ferramentas principal para estimar massas moleculares. Misture o tetrâmero H3/H4 de dois micromolares e o dímero H2A/H2B de quatro micromolares com concentrações crescentes de chaperona de histonas, variando de um a seis micromolares, em um tampão de montagem até um volume final de 50 microlitros.
Incubar a mistura a quatro graus Celsius por 30 minutos. Simultaneamente, pré-tratar 500 nanogramas do plasmídeo PUC-19 superenrolado negativamente com um micrograma da enzima topoisomerase I no tampão de montagem em um volume final a 50 microlitros. Em seguida, combine a solução pré-misturada contendo tetrâmero, dímero e histona chaperona com o DNA plasmático relaxado.
Adicione 100 microlitros de tampão de parada 2X e incube para terminar a reação de montagem desproteinizando o DNA plasmídico. Adicione um volume igual de fenol saturado de Tris no tubo que contém a mistura de reação e misture bem o conteúdo da mistura de reação. Em seguida, centrifugar a amostra.
Recolha suavemente a fase aquosa superior que contém o ADN plasmídico com uma micropipeta e misture um volume igual de clorofórmio. Vórtice a mistura. Em seguida, colete a fase aquosa superior, adicione um volume de 1/10 de acetato de sódio de três molares de pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol gelado.
Misture bem a solução invertendo o tubo três a quatro vezes. Centrifugar a amostra a 16, 200 G durante 10 minutos e eliminar suavemente o sobrenadante. Mantenha os tubos abertos à temperatura ambiente até que até mesmo vestígios de etanol evaporem, deixando o DNA plasmidial precipitado no tubo.
Os resultados analíticos da SEC revelaram que o domínio recombinante da nucleoplasmina N-terminal da proteína Arabidopsis thaliana FKBP53 é um pentâmero de 65 quilodaltons em solução. A amostra de nucleoplasmina submetida a tratamento térmico mostrou que o domínio é altamente termoestável. O domínio nucleoplasmina apresentou estabilidade salina até dois molares de cloreto de sódio e estabilidade de ureia até quatro molares.
Um ensaio pull-down revelou que a interação do domínio nucleoplasmina com o dímero H2A/H2B foi estável até 0,4 molar de cloreto de sódio, enquanto a associação com H3/H4 foi estável até 0,7 molares. A chaperona liga-se simultaneamente ao dímero H2A/H2B e ao tetrâmero H3/H4, independentemente da ordem em que são adicionados à chaperona, indicando locais de interação separados para os oligômeros. As massas moleculares estimadas através da AUC-SV revelam uma estequiometria 1:1 do domínio nucleoplasmina com os oligômeros de histonas.
No ensaio de super-enrolamento de plasmídeos, as chaperonas de histonas de plantas recombinantes AtNRP1 e AtNRP2 aumentaram a quantidade de plasmídeo super-enrolado, sugerindo que ele poderia depositar histonas no DNA para formar nucleossomos, causando super enrolamento do DNA. O ensaio de super-enrolamento de plasmídeos requer cuidados especiais e possível otimização para caracterização do DNA de histonas e chaperonas. A telemetria de caracterização isomérica pode ser usada como um acompanhamento de experimentos analíticos de exclusão de tamanho para confirmar a estabilidade de ligação.
