体外 使用分析、下拉和伴侣测定表征组蛋白伴侣

我们的协议描述了如何使用下拉测定分析体积排阻色谱、分析超离心和组蛋白伴侣测定等技术来确认蛋白质是否为组蛋白伴侣。当使用串联时，这里介绍的技术可以直接应用于表征推定的伴侣。他可以配合结构生物学技术。

这些技术适用于染色质研究领域。然而，根据需要，可以将单个方法应用于任何其他感兴趣的蛋白质。演示该程序的将是我实验室的博士生Surajit Gandhi先生，用于复杂的下拉测定;女士。

博士生Archana Samal与Ruchir C.Bobde先生一起进行分析超离心实验;Somanath Baral先生，博士生;与Ketul Saharhan先生一起进行质粒超螺旋测定 首先，将5微摩尔组蛋白伴侣与20微摩尔H2A / H2B二聚体混合在300微升平衡缓冲液中。离心组蛋白伴侣 H2A/H2B 复合物以去除任何沉淀物。

将样品加载到用平衡缓冲液预平衡的离心柱上。用100柱体积或4毫升洗涤缓冲液洗涤色谱柱，以除去多余的H 2 / H 2B二聚体。接下来，将组蛋白伴侣 H2A/H2B 复合物与 20 至 60 微摩尔 H3/H4 四聚体混合。

用100柱体积或4毫升洗涤缓冲液重洗色谱柱以除去任何未结合的H3/H4四聚体，然后用洗脱缓冲液洗脱样品。将洗脱的样品置于18%SDS-PAGE下。然后，用考马斯亮蓝色R250染色并可视化凝胶。

使用分析体积排阻色谱法，用透析缓冲液单独纯化组蛋白伴侣中的 H2A/H2B 二聚体、H3/H4 四聚体。保存运行中的缓冲液，以便稍后准备进一步稀释液，并用作AUC单元中的参考。对于AUC样品，使用保存的透析缓冲液将纯化的伴侣与二聚体或四聚体在单独的管中混合至450微升的最终体积，以达到0.3至0.6的OD 280。

将细胞与双扇区中心件和石英窗口组装，石英窗口配有带有吸光度检测器的分析超离心机。将400微升样品溶液和420微升透析缓冲液分别填充到细胞的参比和样品扇区中。称量并准确平衡电池，并将其装入四孔钛转子中。

使用单元格底部和转子上的标记对齐单元格。将转子装入离心机中，盖上盖子，然后开始运行，这样可以形成真空并稳定温度。对于数据分析，使用SEDNTERP程序根据蛋白质的氨基酸组成计算蛋白质缓冲组分和部分比体积的密度和粘度。

将数据从AUC机器加载到程序SEDFIT中。定义弯月面、红线、单元格底部、蓝线和数据分析边界绿线。选择连续 CS 分布作为模型。

在参数部分中，将分辨率设置为最大 100。接下来，将最小沉降系数设置为零，将最大值设置为 10 到 15。最初将摩擦比设置为 1.2，并选择浮点以从数据中派生比率。

将一个西格玛正则化的 F 比设置为 0.68。设置从 SEDNTURP 获得的部分比容、缓冲密度和粘度。按运行以允许软件求解 lam 方程。

按适合进行优化。在主工具栏的显示功能中选择以CS为单位显示峰Mw以估计分子量。将两微摩尔 H3/H4 四聚体和四微摩尔 H2A/H2B 二聚体与增加浓度的组蛋白伴侣（范围从 1 到 6 微摩尔）在组装缓冲液中混合至 50 微升的最终体积。

将混合物在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。同时，在组装缓冲液中用一微克拓扑异构酶I酶预处理500纳克负超螺旋PUC-19质粒，最终体积为50微升。接下来，将含有四聚体、二聚体和组蛋白伴侣的预混合溶液与松弛的血浆 DNA 合并。

加入 100 μL 2X 终止缓冲液并孵育以通过质粒 DNA 脱蛋白结束组装反应。在装有反应混合物的管中加入等体积的Tris饱和苯酚，并将反应混合物的内容物充分混合。然后，离心样品。

用微量移液管轻轻收集含有质粒DNA的上层水相，并混合等体积的氯仿。涡旋混合物。接下来，收集上层水相，加入1/10体积的pH 5.5的三摩尔乙酸钠和2.5体积的冰冷乙醇。

通过将试管倒置三到四次来充分混合溶液。将样品以16， 200 G离心10分钟，然后轻轻弃去上清液。在室温下保持试管打开，直到微量乙醇蒸发，将沉淀的质粒DNA留在试管中。

SEC分析结果显示，拟南芥蛋白FKBP53的重组N端核蓝蛋白结构域是溶液中65千道尔顿的五聚体。经热处理的核蓝蛋白样品表明该结构域具有很高的热稳定性。核蓝蛋白结构域显示出高达两摩尔氯化钠的盐稳定性和高达四摩尔的尿素稳定性。

下拉测定显示，核蓝蛋白结构域与H2A/H2B二聚体的相互作用在0.4摩尔氯化钠下稳定，而与H3/H4的结合稳定在0.7摩尔时稳定。分子联同时结合H2A/H2B二聚体和H3/H4四聚体，无论它们加入分子序如何，都表明低聚物的单独相互作用位点。通过AUC-SV估计的分子量揭示了核质低聚物核云溶蛋白结构域的1:1化学计量。

在质粒超卷曲测定中，重组植物组蛋白伴侣AtNRP1和AtNRP2增加了超螺旋质粒的数量，表明它可以将组蛋白沉积到DNA上形成核小体，导致DNA超级卷曲。质粒超螺旋测定需要特别注意组蛋白DNA和伴侣表征，并可能进行优化。异构体表征遥测可用作分析体积排阻实验的后续操作，以确认结合稳定性。