Os modelos experimentais de doação de órgãos geralmente mimetizam situações isoladas de lesão tecidual relacionadas ao processo de morte e/ou eventos relacionados à preservação e implantação do órgão. Esses modelos são muito úteis no desenvolvimento de terapias que buscam aumentar o número de doações e, consequentemente, diminuir a lista de ponderação dos potenciais receptores. Nesse sentido, tornou-se importante o desenvolvimento de diferentes modelos, como os indutores de morte encefálica e morte circulatória.
Uma vez que esses eventos estão associados a diferentes processos deletérios que comprometem a funcionalidade dos órgãos doados e dos tecidos. Anestesia e preparo pré-cirúrgico. Colocar o rato numa câmara fechada com isoflurano a 5% durante um a quatro minutos.
Confirme a anestesia adequada verificando o reflexo de pinça do dedo do pé. Na ausência de reações reflexas, realizar intubação orotraqueal, Angiocath calibre 14 com o auxílio de um laringoscópio pediátrico. Com ventilador mecânico previamente ajustado e volume corrente de 10 mililitros por quilograma, 90 ciclos por minuto e PEEP 3,0 centímetros H2O, conecte o cateter traqueal ao ventilador e ajuste a concentração anestésica para 2% Remova os pelos das regiões de interesse, cabeça, pescoço, tórax e abdômen.
Em seguida, com gaze, limpeza do campo cirúrgico e da cauda do animal com solução alcoólica de digluconato de clorexidina, o procedimento de desinfecção a 2% foi repetido três vezes. Corte a ponta da cauda do animal, coloque o polegar e o indicador sobre a base da cauda e, em seguida, pressione e deslize-os para longe da base. Coletar uma amostra de sangue periférico, 20 microlitros através da cauda para a contagem total de leucócitos. Traqueostomia.
Realizar dissecção longitudinal da traqueia cervical, iniciando do terço médio do pescoço até a fúrcula esternal. Incisão de aproximadamente 1,5 centímetros. Após incisão da pele e tecido subcutâneo, dissecar os músculos cervicais até que a traqueia fique exposta.
Coloque a ligadura de seda 2.0 sob a traqueia. Com a microtesoura, traqueostomia o terço superior da traqueia para uniformizar a ventilação. Corte horizontalmente a traqueia entre dois anéis cartilaginosos para acomodar o diâmetro de uma cânula metálica, 3,5 centímetros.
Insira o tubo de ventilação e fixe-o com ligaduras preparadas. Conecte o tubo de ventilação ao sistema de ventilação de pequenos animais. Ventilar o rato com um volume corrente de 10 mililitros por quilograma, taxa de 70 ciclos por minuto e PEEP de 3 centímetros H2O.
Cateterismo de artéria e veia femoral. Assim, exponha o triângulo femoral através de uma pequena incisão, de aproximadamente 1,5 centímetros na região inguinal. Identificar e isolar os vasos femorais.
Para este procedimento, utilizar um estereomicroscópio com aumento de 3,2 vezes. Coloque duas ligaduras de seda 4.0 abaixo dos vasos sanguíneos, veia ou artéria, uma distalmente e outra proximalmente. Fechar a ligadura mais distal e colocar um nó pré-ajustado na ligadura proximal e puxar.
Insira o cateter através de uma pequena incisão pré-formada nos vasos. Fixar a cânula para evitar luxação. Conecte o cateter arterial a um transdutor de pressão e a um sistema de monitorização de sinais vitais para registrar a PAM.
O transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal. Conecte o cateter de arco e flecha a um transdutor de pressão e a um sistema de monitoramento de sinais vitais para registrar a PAM. O transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal.
Coloque o cateter da seringa de 3 mililitros na veia, visando hidratação e exsanguinação quando necessário. Indução de choque hemorrágico. Através do eixo venoso e com uma seringa heparinizada, remova pequenos volumes de sangue até atingir valores de PAM de aproximadamente 50 milímetros de mercúrio.
Assim, estabelecendo-se choque hemorrágico. Nota, alíquotas de sangue devem ser colhidas em intervalos de 10 minutos. Mantenha a pressão estável em aproximadamente 50 milímetros de mercúrio por um período de 360 minutos.
Para fazer isso, remova ou adicione alíquotas de sangue se a pressão aumentar ou diminuir, respectivamente. Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia. Ao final do protocolo, retirar o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total para coleta e congelar em nitrogênio líquido ou colocar em solução fixadora para estudos posteriores.
Indução de morte circulatória. Para induzir a morte circulatória, administrar 150 miligramas por quilograma de tiopental sódico através da linha venosa. Em seguida, desligue o sistema de ventilação.
Nota-se a diminuição progressiva da PAM. O animal deve permanecer em isquemia aquecida à temperatura ambiente por 180 minutos. Ao final do protocolo, reconectar os pulmões ao ventilador mecânico e retirar o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total para coleta.
E congelar rapidamente em nitrogênio líquido, ou colocar em solução de fixação para estudos posteriores. Indução de morte encefálica. Coloque o rato na posição prona.
Retire a pele do crânio usando tesoura cirúrgica. Perfurar um furo de calibre 1 milímetro, 2,8 milímetros anterior, 10 milímetros ventral e 1,5 milímetros lateral à sutura sagital. Insira todo o cateter balão na cavidade craniana e certifique-se de que o balão esteja pré-preenchido com soro fisiológico, 500 microlitros.
Com a ajuda de uma seringa, inflar rapidamente o cateter. Confirmar a morte encefálica observando elevação abrupta da PAM. Reflexo de Cushing, ausência de reflexos, midríase bilateral e apneia.
Após a confirmação, suspender a anestesia e manter o animal em ventilação mecânica por 360 minutos. Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia. Ao final do protocolo, retirar o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total para coleta. Resultados.
Após a insuflação do cateter, o grupo com morte encefálica apresentou aumento abrupto dos níveis pressóricos. O pico hipertensivo é um evento peculiar relacionado ao aumento da pressão intracraniana, podendo ser considerado a primeira evidência do estabelecimento da morte encefálica. Esse pico de pressão foi seguido por uma rápida diminuição da PAM.
A hipotensão arterial persistiu por aproximadamente 50 minutos, após os quais os níveis da PAM retornaram a valores próximos aos basais. Ao contrário do grupo de morte encefálica, a diminuição da PAM no grupo choque hemorrágico está associada à retirada de alíquotas de sangue nos primeiros 10 minutos do experimento. O choque hipovolêmico foi mantido por 360 minutos.
Seis horas após o início do choque hemorrágico, os animais apresentaram aumento da resistência do tecido pulmonar, seguido de redução da complacência do sistema respiratório. Para avaliar as alterações no edema pulmonar, a relação peso úmido para seco foi examinada. Nesse contexto, a morte encefálica apresentou maior edema em relação ao grupo choque hemorrágico e morte circulatória.
Finalmente, o grupo choque hemorrágico associou-se ao aumento do número total de leucócitos sistêmicos em relação aos valores basais e em relação ao grupo morte encefálica. Isso foi acompanhado por níveis aumentados de expressão de IL1 Beta no grupo de morte encefálica e no grupo de choque hemorrágico do que no grupo de morte circulatória. O grupo choque hemorrágico também apresentou níveis mais elevados de TNF alfa em comparação com o grupo morte encefálica e o grupo morte circulatória.
Os modelos de doadores de órgãos aqui descritos são ferramentas potenciais no estudo das mudanças associadas às diferentes metodologias de retirada de enxertos e podem fornecer meios para obter uma compreensão completa do impacto da qualidade desses órgãos nos resultados pós-transplante. Dada a reprodutibilidade e confiabilidade das metodologias aqui apresentadas.
