I modelli sperimentali di donazione di organi generalmente simulano situazioni isolate di lesione tissutale correlata al processo di morte e/o eventi legati alla conservazione e all'impianto dell'organo. Questi modelli sono molto utili nello sviluppo di terapie che cercano di aumentare il numero di donazioni, e di conseguenza diminuire la lista di ponderazione dei potenziali riceventi. Di conseguenza, è diventato importante sviluppare diversi modelli, come quelli che inducono la morte cerebrale e la morte circolatoria.
Poiché questi eventi sono associati a diversi processi deleteri che compromettono la funzionalità degli organi e dei tessuti donati. Anestesia e preparazione prechirurgica. Metti il ratto in una camera chiusa con isoflurano al 5% per uno o quattro minuti.
Confermare la corretta anestesia controllando il riflesso di pizzicamento della punta. In assenza di reazioni riflesse, eseguire l'intubazione orotracheale, calibro 14 Angiocath con l'ausilio di un laringoscopio pediatrico. Con un ventilatore meccanico precedentemente regolato e un volume corrente di 10 millilitri per chilogrammo, 90 cicli al minuto e PEEP 3,0 centimetri H2O, collegare il catetere tracheale al ventilatore e regolare la concentrazione di anestetico al 2%Rimuovere il pelo dalle regioni di interesse, testa, collo, torace e addome.
Quindi, utilizzando una garza, pulire il campo chirurgico e la coda dell'animale con una soluzione alcolica di clorexidina digluconato, la procedura di disinfezione al 2% è stata ripetuta tre volte. Taglia la punta della coda dell'animale, posiziona il pollice e l'indice sulla base della coda, quindi premi e fai scorrere via dalla base. Raccogliere un campione di sangue periferico, 20 microlitri attraverso la coda per la conta totale dei leucociti. Tracheostomia.
Eseguire la dissezione longitudinale della trachea cervicale, partendo dal terzo medio del collo fino all'incavo soprasternale. Incisione di circa 1,5 centimetri. Dopo l'incisione della pelle e del tessuto sottocutaneo, sezionare i muscoli cervicali fino a quando la trachea non è esposta.
Posizionare la legatura in seta 2.0 sotto la trachea. Utilizzando micro forbici, le tracheostomie colpiscono il terzo superiore della trachea per ottenere una ventilazione uniforme. Tagliare orizzontalmente la trachea tra due anelli cartilaginei per accogliere il diametro di una cannula metallica, 3,5 centimetri.
Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con legature predisposte. Collegare il tubo di ventilazione al sistema di ventilazione per piccoli animali. Ventilare il ratto con un volume corrente di 10 millilitri per chilogrammo, una velocità di 70 cicli al minuto e una PEEP di 3 centimetri H2O.
Cateterismo dell'arteria e delle vene femorali. Quindi, esponi il triangolo femorale attraverso una piccola incisione, di circa 1,5 centimetri nella regione inguinale. Identificare e isolare i vasi femorali.
Per questa procedura, utilizzare uno stereomicroscopio con ingrandimento 3,2x. Posizionare due legature di seta 4.0 sotto i vasi sanguigni, la vena o l'arteria, una distale e l'altra prossimale. Chiudere la legatura più distale e inserire un nodo pre-regolato nella legatura prossimale e tirare.
Inserire il catetere attraverso una piccola incisione preformata nei vasi. Fissare la cannula per evitare lussazioni. Collegare il catetere arterioso a un trasduttore di pressione e a un sistema di monitoraggio dei segni vitali per registrare la MAP.
Il trasduttore deve essere posizionato a livello del cuore dell'animale. Collegare il catetere per tiro con l'arco a un trasduttore di pressione e a un sistema di monitoraggio dei segni vitali per registrare la MAP. Il trasduttore deve essere posizionato a livello del cuore dell'animale.
Posizionare il catetere siringa per 3 millilitri nella vena, mirando all'idratazione e al dissanguamento quando necessario. Induzione da shock emorragico. Attraverso l'asse venoso e con una siringa eparinizzata, prelevare piccoli volumi di sangue fino a raggiungere valori di MAP di circa 50 millimetri di mercurio.
Così, stabilendo uno shock emorragico. Si noti che le aliquote di sangue devono essere prelevate a intervalli di 10 minuti. Mantenere la pressione stabile a circa 50 millimetri di mercurio per un periodo di 360 minuti.
A tale scopo, rimuovere o aggiungere aliquote di sangue se la pressione aumenta o diminuisce rispettivamente. Metti una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia. Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale per la raccolta e congelarlo in azoto liquido o metterlo in soluzione fissante per ulteriori studi.
Induzione della morte circolatoria. Per indurre la morte circolatoria, somministrare 150 milligrammi per chilogrammo di tiopentale di sodio attraverso la linea venosa. Quindi, spegnere il sistema di ventilazione.
Si noti la progressiva diminuzione della MAP. L'animale deve rimanere in ischemia calda a temperatura ambiente per 180 minuti. Al termine del protocollo, ricollegare i polmoni al ventilatore meccanico e prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale per la raccolta.
E congelare in azoto liquido o metterlo in soluzione di fissazione per ulteriori studi. Induzione della morte cerebrale. Metti il ratto in posizione prona.
Rimuovere la pelle dal cranio usando le forbici chirurgiche. Praticare un foro di calibro 1 millimetro, 2,8 millimetri anteriormente e 10 millimetri ventrale e 1,5 millimetri lateralmente alla sutura sagittale. Inserire l'intero catetere a palloncino nella cavità cranica e assicurarsi che il palloncino sia preriempito con soluzione fisiologica, 500 microlitri.
Con l'aiuto di una siringa, gonfiare rapidamente il catetere. Confermare la morte cerebrale osservando l'aumento improvviso della MAP. Riflesso di Cushing, assenza di riflessi, midriasi bilaterale e apnea.
Dopo la conferma, interrompere l'anestesia e tenere l'animale in ventilazione meccanica per 360 minuti. Posizionare una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia. Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale per la raccolta. Risultati.
Dopo l'insufflazione del catetere, il gruppo con morte cerebrale ha sperimentato un brusco aumento dei livelli di pressione sanguigna. Il picco ipertensivo è un evento peculiare correlato all'aumento della pressione intracranica, e può essere considerato la prima evidenza dell'instaurarsi della morte cerebrale. Questa pressione di picco è stata seguita da una rapida diminuzione della MAP.
L'ipotensione è persistita per circa 50 minuti, dopodiché i livelli di MAP sono tornati a valori vicini a quelli basali. A differenza del gruppo di morte cerebrale, la diminuzione della MAP nel gruppo di shock emorragico è associata al ritiro di aliquote di sangue nei primi 10 minuti dell'esperimento. Lo shock ipovolemico è stato mantenuto per 360 minuti.
Sei ore dopo l'insorgenza dello shock emorragico, gli animali hanno mostrato una maggiore resistenza del tessuto polmonare, seguita da una ridotta compliance del sistema respiratorio. Per valutare i cambiamenti nell'edema polmonare, è stato esaminato il rapporto tra peso umido e secco. In questo contesto, la morte cerebrale ha mostrato un maggiore edema rispetto al gruppo con shock emorragico e morte circolatoria.
Infine, il gruppo shock emorragico è stato associato a un aumento del numero totale di leucociti sistemici rispetto ai valori basali e in relazione al gruppo di morte cerebrale. Ciò è stato accompagnato da un aumento dei livelli di espressione di IL1 Beta nel gruppo di morte cerebrale e nel gruppo di shock emorragico rispetto al gruppo di morte circolatoria. Il gruppo di shock emorragico ha anche mostrato livelli più elevati di TNF alfa rispetto al gruppo di morte cerebrale e al gruppo di morte circolatoria.
I modelli di donatori di organi qui descritti sono potenziali strumenti nello studio dei cambiamenti associati a diverse metodologie di prelievo degli innesti e potrebbero fornire mezzi per ottenere una piena comprensione dell'impatto della qualità di questi organi sugli esiti post-trapianto. Data la riproducibilità e l'affidabilità delle metodologie qui presentate.
