Este protocolo pode capturar cinética em tempo real em um nível de célula única. Podemos medir parâmetros celulares individuais em resposta à infecção pelo HIV e associar eventos de sinalização precoce com etapas atrasadas do ciclo de vida viral. Esta é uma alternativa escalável integrada aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic para classificação de células únicas, cultivo, imagem e automação de software.
Este é o primeiro método estabelecido para cultura e imagem de células únicas nanofluidas, de alta produtividade e longitudinais. Essa técnica pode ser amplamente adotada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas em uma variedade de estados da doença. A demonstração visual deste método é importante para transmitir como o experimento é configurado, como as células são classificadas opticamente em canetas e como configurar infusões através do chip.
Para começar, prepare a solução de carregamento Fluo-4 AM fresca adicionando 25 microliters de solvente concentrado de detergente 100X e 2,5 microliters de 1.000X Fluo-4 AM a um tubo de 1,5 mililitro, depois vórtice de tex para misturar. Pipeta 2,5 mililitros de mídia cultural na solução de carregamento e inverter para misturar. Centrifugar dois milhões de células MT-4 a 500 vezes G por três minutos, depois remover a mídia e resuspensar a pelota em dois mililitros da solução de carregamento Fluo-4 AM preparada.
Células suspensas de pipeta em uma placa de Petri de 35 milímetros. Incubar a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos e incubar por mais 15 a 30 minutos à temperatura ambiente. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga e centrífuga as células a 500 vezes G por três minutos, em seguida, remova o supernatante.
Resuspengue a pelota celular pipetando em um mililitro do meio cultural e centrífuga a 500 vezes G durante três minutos para lavar. Resuspend a pelota celular por pipetação no meio da cultura a uma concentração de dois milhões de células por mililitro para pelo menos 50 microlitres. Para preparar um chip com a solução de molhar, que facilita a escrita celular, carregue tubos de centrífugas contendo dois mililitros de solução de molhar e 50 mililitros de água desionizada no instrumento com um novo chip optofluido e execute a função de chip molhado que inundará o chip com a solução de molhar.
Incubar o chip a 50 graus Celsius e lavar o chip com água três vezes. Uma vez feito o flushing de água, lave o chip com três ciclos de 250 microliters de mídia cultural. Suplemente a suspensão celular da etapa anterior com uma por 100 partes de detergente F127 soluto antes do carregamento para reduzir a probabilidade de as células grudando nos canais do chip.
Use a agulha de exportação de instrumentos para importar células de um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com a operação de carga e importação de pequeno volume para um volume de embalagem de cinco microliter. Células de caneta usando um posicionamento optoeletrônico otimizado ou tensão OEP de 4,3 volts e cinco micrômetros por segunda velocidade de gaiola usando a função auto-caneta, que irá detectar automaticamente células únicas, cercá-las com uma gaiola OEP, e movê-las para uma caneta próxima. Se as células de interesse permanecerem após a escrita automática, use a função de caneta manual para selecionar células-alvo e uma caneta de destino.
Uma vez que a escrita esteja completa, lave o chip com três ciclos de 250 microliters de mídia cultural para limpar quaisquer células não gastas restantes do chip. Após a escrita de células, obtenha imagens fluorescentes de células nos canais FITC, Texas Red e DAPI para medir a linha de base Fluo-4, mCherry e autofluorescência. Infundir HIV-1 no microchip a uma concentração de 13 nanogramas de HIV-1 NLCI por dois milhões de células, canalizar lentamente a suspensão para dentro do chip através da agulha de exportação.
Imediatamente após a adição do HIV-1, obtenha repetidamente imagens nos canais FITC e DAPI ao longo de um curso de tempo de 10 minutos. Obtenha imagens nos canais Texas Red e DAPI em um, dois, três e quatro dias após a infecção. Essa metodologia foi utilizada para identificação e agrupamento de células infectadas pelo HIV e não infectadas por meio da medição do mCherry.
Células com uma mudança no sinal mCherry maior ou menor que 40.000 intensidade fluorescente média foram agrupadas na alta mCherry ou mCherry baixa população, respectivamente. Esses aglomerados foram analisados para cinética de influxo de cálcio medindo cálcio intracelular usando fluorescência Fluo-4 repetidamente durante um curso de nove minutos, o que demonstrou o fluxo precoce de cálcio em células infectadas pelo HIV. Observou-se correlação positiva significativa entre o influxo de cálcio e a florescência mCherry.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de começar com as células dentro da faixa de crescimento exponencial tanto para a produção de vírus quanto para a infecção, porque as células supercultivadas resultarão em uma redução drástica do sinal a partir deste ensaio. Trabalhar com HIV-1 pode ser perigoso. Portanto, as práticas BSL-2, conforme indicado no OSHA Bloodborne Pathogen Standard, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
Esta técnica é excitante porque nos permitirá estudar alterações fenotípicas ou transcritórias de células únicas em condições controladas. Isso tem amplo potencial para correlacionar o impacto dos estímulos nas vias moleculares em muitos tipos de células.
